[发明专利]微波萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽粪便中7种结合态雌激素的方法

说明书

本发明涉及一种微波萃取‑固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽粪便中7种结合态雌激素的方法。该方法为：(1)粪便样品预处理，分别加入17β‑雌二醇D₃ 3‑β‑D‑葡糖苷酸、17β‑雌二醇硫酸钠‑D₄这两种指示回收率的内标物；再经提取溶剂微波萃取、过滤收集提取液，用水稀释，调pH值；(2)固相萃取富集净化目标雌激素；(3)采用内标法，用液质联用仪定量检测畜禽粪便中7种结合态雌激素。该方法通过对提取方法、富集净化条件、液质检测条件进行优化，同时通过选用合适的内标物，可一次性同时检测出畜禽粪便中7种结合态雌激素的残留情况，具有高回收率、高灵敏度、高稳定性、低检测限、检测结果更真实可靠等优点。

技术领域

本发明属于有机污染物质残留检测技术领域，涉及一种畜禽粪便中结合态雌激素的检测方法，特别涉及一种微波萃取-固相萃取前处理结合液相色谱串联质谱技术同时检测畜禽粪便中7种结合态雌激素含量的方法。

技术背景

随着畜禽养殖业向现代化、规模化和集约化的方向快速发展，畜禽养殖污染日益严重，通过畜禽粪便进入环境中的雌激素已超出环境容量。内源类固醇雌激素由畜禽养殖场粪尿进入环境中，微量内源类固醇雌激素便可强烈干扰人类和其他动物的内分泌系统，改变机体在发育和成年阶段胞内信号肽过程，从而导致发育、行为和生殖问题。畜禽粪便基质本身是一种复杂的环境样品，有效的样品提取和净化是准确测定其中雌激素含量的前提。因此，一种有效的提取和净化方法对测定畜禽粪便中雌激素含量尤为重要。

样品前处理中常用的提取方法主要有索式萃取法、加速溶剂萃取法、超声萃取法、微波萃取法等。其中，微波萃取法对容器中的溶剂和样品直接进行加热，样品与溶剂可在很短的时间内升高到很高的温度，提高了加热速率，强化了溶剂萃取效率，具有时间短、节省试剂、回收率高等优点，尤其适用于粪便等复杂基质。同时，提取剂的选择对回收率高低有着直接的影响。理想的环境样品前处理方法是不破坏待测组分的形态，减少污染，并且能使待测组分与基质有效分离。目前常用的检测方法主要有高效液相色谱法(HLPC)和高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)。HPLC-MS/MS兼具HLPC强的分离能力，同时又具有MS高灵敏度和极强的定性鉴定能力，是目前检测环境复杂基质结合态雌激素残留最有效的手段之一，具有分析范围广、分离能力强、定性分析结果可靠、检测限低、分析时间快和自动化程度高等优点。可准确地定性、定量测定复杂混合物的组分。

目前针对畜禽粪便中结合态雌激素的分离富集和共检测尚无一套完整可靠的检测方法，因此，急需一种检测结果稳定、干扰小，能够快速、高效、灵敏、准确，同时检测出畜禽粪便中多种结合态雌激素的方法，包括分离富集和共检测的完整可靠的检测方法。

发明内容

本发明的目的旨在克服现有技术的不足，提供了一种检测结果稳定、干扰小、快速、高效的同时测定畜禽粪便中7种结合态雌激素的方法，即一种微波萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽粪便中7种结合态雌激素的方法。

本发明的技术构思如下：

本发明的方法采用微波萃取结合固相萃取作为畜禽粪便样品的前处理，并以高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)作为检测器，同时测定样品中7种结合态雌激素的含量。选择畜禽粪便中常见的7种结合态雌激素雌酮3-(BETA-D-葡糖苷酸)钠盐(E1-3G)、17β-雌二醇17-硫酸钾盐(E2-S-K)、BETA-雌二醇3-硫酸钠盐(E2-3S)、17β-雌二醇3-(β-D-葡糖苷酸)钠盐(E2-3G)、雌三醇-3-O-β-D葡糖苷酸钠盐(E3-3G)、雌酮3-硫酸钠(E1-3S)、17β-雌二醇17-β-D葡糖苷酸(E2-G)，采用单因素试验，选择最优的条件，得到最优条件下结合态雌激素的最大萃取率。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种微波萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽粪便中7种结合态雌激素的方法，按以下步骤进行：

(1)结合态雌激素的提取：微波萃取