[发明专利]利用管盖内切虫快速提取单条线虫DNA的方法

说明书

本发明公开了一种利用管盖内切虫快速提取单条线虫DNA的方法，主要是在EP管盖内加入裂解液，然后将单条线虫置于裂解液中；再用注射器针头在管盖内划一凹槽，将线虫顺放于凹槽中，接着用注射器针头垂直将线虫切为两段，将管体倒盖到管盖上，瞬时离心，并置于60℃反应5min，98℃反应2min，即得单条线虫DNA。本发明还公开了一种鉴定线虫的方法。与现有的PCR管内切虫相比，本发明方法操作更为简单，且不需要高超技巧和专业训练，切虫时间大大缩短，切虫效率高；而且与现有1‑10小时的提取时间相比，本发明方法提取时间仅15分钟，提取时间短；本发明方法重复性和稳定性好，成本低，适于大规模的筛选和鉴定。

技术领域

本发明属于线虫DNA的提取方法领域，具体涉及一种利用管盖内切虫快速提取单条线虫DNA的方法；还涉及一种鉴定线虫的方法。

背景技术

植物寄生线虫是重要的植物病原物，每年给世界农业生产造成的经济损失达1000亿美元以上。在我国常见的有滑刃线虫属(Aphelenchoides)、茎线虫属(Ditylenchus)、孢囊线虫属(Heterodera)，根结线虫属(Meloidogyne)和根腐线虫属(Pratylenchus)等线虫。这些线虫寄主范围广，给粮食作物、园艺作物和林业树木等造成严重危害，很多有害线虫已被我国列为检疫对象。

为降低植物寄生线虫对农业生产造成的损失，以及为便于对线虫进行检疫，首先需要对线虫进行分类鉴定。传统的线虫鉴定方法主要依赖于形态学观察，主观依赖性较强，要求鉴定者具有极为丰富的经验和技巧，尤其是在一些近似种的鉴定上比较困难。近几年，分子生物学技术在线虫的鉴定分类上已得到广泛应用。而实现分子水平上鉴定的首要条件就是要获得线虫DNA。目前获得线虫DNA的方法主要分为大量线虫DNA提取和单条线虫DNA提取两种。由于实际从田间受害作物和病土中分离获得的线虫通常是多个种类的混合种群。因此，利用单条线虫对线虫进行鉴定分类的方法更为准确和可靠，对于线虫的检疫和防治也更具意义。

对单条线虫进行分子鉴定，首先需要提取单条线虫的基因组DNA。化学裂解法和物理裂解法曾用于对单条线虫DNA的提取，但是由于这些方法存在操作步骤复杂、花费时间长等缺点，逐渐被酶解法所取代，酶解法主要是利用蛋白酶K的降解作用来提取单条线虫基因组DNA。目前，用昆虫针或解剖刀在PCR管内切割线虫，然后加入裂解液提取线虫基因组DNA的方法(CN103014157A；CN103602668A；容万韬等.华北农学报，2014.29(2):127-132)因无需转管、无需冻融等操作，具有相对简单、且提取成功率高等优点，将线虫DNA的提取提高到较高的水平，但是其在管内切割线虫的方法对操作人员要求高，切割操作难度大，非专业人士需要反复练习后才能掌握，大大限制了该技术的推广应用，另外利用这些方法提取线虫DNA的时间比较长，因此，应该寻找操作更加简单、提取时间更短的提取线虫DNA的方法，以满足防治研究和检疫的需求。

发明内容

针对管内切虫提取线虫DNA方法存在的对操作人员要求高，切割操作难度大、且提取时间长等问题，本发明目的在于提供一种利用管盖内切虫快速提取单条线虫DNA的方法；与现有方法相比，该方法具有简单易行、对操作人员要求低，提取速度快，且成本低等优点。

本发明另一目的在于提供一种鉴定线虫的方法。

为实现以上目的，本发明的技术方案如下：

一种利用管盖内切虫快速提取单条线虫DNA的方法，包括如下步骤：

(1)、线虫洗涤：在灭菌的表面皿或洁净载玻片上滴加灭菌的双蒸水，用灭菌的挑针将线虫挑入到所述的双蒸水中洗涤；