[发明专利]胶质母细胞瘤干细胞原代培养方法在审
| 申请号： | 201910216211.1 | 申请日： | 2019-03-21 |
| 公开（公告）号： | CN109943531A | 公开（公告）日： | 2019-06-28 |
| 发明（设计）人： | 董军;施佳;王海洋;代兴亮 | 申请（专利权）人： | 苏州大学附属第二医院 |
| 主分类号： | C12N5/095 | 分类号： | C12N5/095 |
| 代理公司： | 常州市权航专利代理有限公司 32280 | 代理人： | 黄晶晶 |
| 地址： | 215000 *** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 原代培养 胶质母细胞瘤 标记物 干细胞 干细胞标记物 少突胶质细胞 神经胶质细胞 分化 克隆化培养 神经元标记 细胞 传代培养 单个细胞 工具细胞 基础实验 贴壁生长 细胞表达 血清诱导 成球性 冻存 体外 显微镜 悬浮 生长 | ||
1.一种胶质母细胞瘤干细胞的原代培养方法，其特征在于，所述方法至少包括以下步骤：
（1）GSCs原代培养：
a)提供胶质母细胞瘤组织单细胞悬液；
b)接种，去除贴壁细胞；
c)在显微镜下收集细胞悬浮球，消化，制成单细胞悬液；
d)取单个细胞接种，培养；
e)取悬浮生长的细胞球，接种，培养至细胞直径150~250微米。
2.如权利要求1所述的胶质母细胞瘤干细胞的原代培养方法，其特征在于，所述步骤a）具体为将胶质母细胞瘤组织碎化之后加入II型胶原酶并置于充有CO2的细胞培养箱中，吹散，制成单细胞悬液。
3.如权利要求2所述的胶质母细胞瘤干细胞的原代培养方法，其特征在于，所述步骤a）中肿瘤组织从细胞培养箱中取出后用250~400目滤网过滤。
4.如权利要求1所述的胶质母细胞瘤干细胞的原代培养方法，其特征在于，所述步骤b）中接种之前还包括去除红细胞，所述去除红细胞的方法为加入红细胞裂解液，离心，弃上清。
5.如权利要求4所述的胶质母细胞瘤干细胞的原代培养方法，其特征在于，所述步骤b）中去除红细胞后用干细胞培养基重悬细胞，调整细胞浓度，接种，换液，去除贴壁细胞，培养。
6.如权利要求1所述的胶质母细胞瘤干细胞的原代培养方法，其特征在于，所述步骤d)中显微镜放大倍数为×100倍，每个视野少于5个细胞时取单个细胞，然后接种。
7.如权利要求1所述的胶质母细胞瘤干细胞的原代培养方法，其特征在于，所述步骤d)培养过程中间歇性添加干细胞培养基。
8.如权利要求1所述的胶质母细胞瘤干细胞的原代培养方法，其特征在于，所述步骤e)取悬浮生长的细胞球的时间为细胞培养第12~16天时。
9.如权利要求1所述的胶质母细胞瘤干细胞的原代培养方法，其特征在于，所述方法还包括2）GSCs传代培养，所述GSCs传代培养是指将细胞悬液离心，去除上清，加细胞消化液，孵育，离心去除上清，加入细胞培养基培养。
10.如权利要求9所述的胶质母细胞瘤干细胞的原代培养方法，其特征在于，所述方法还包括3）GSCs冻存，所述GSCs冻存是指将传代培养之后的细胞依次置于3.5~4℃冰箱、-19.5~-20℃冰箱、-75~-80℃冰箱后移入液氮罐中保存。
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