[发明专利]一种高效的高山离子芥转基因植株的制备方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效的高山离子芥转基因植株的制备方法，所述的制备方法主要包括以下步骤：(1)载体构建和农杆菌转化，(2)农杆菌介导的压力侵染，(3)愈伤组织与农杆菌共培养及筛选，(4)GUS染色鉴定及后期培养。与普通转化方法相比，在转化过程中施加外源压力能够显著提高农杆菌介导的转基因的效率。该方法具有操作简便、转化效率高、稳定性好以及重复性强等特点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效的高山离子芥转基因植株的制备方法。

背景技术

高山离子芥(Chorispora bungeana)是一种十字花科的高山冰缘植物，主要生长在海拔3600～3900m的乌鲁木齐河源区流石碓地区，该地区昼夜温差极大，并且年平均温度在-5～-7℃之间，6～8月平均气温仅为3.6℃，是一种伴随反复冻融现象的冰冻环境，因此高山离子芥是一种研究植物抗冻机制的特色冰缘植物，但是由于高山离子芥的转化体系尚不成熟，传统转化方法效率低且不稳定，这严重限制了对其抗逆基因的挖掘和功能的研究，也影响着抗逆基因在农牧业上的应用。对于其转基因方法的改进，可为研究包括高山离子芥在内的高山冰缘植物提供新的技术支持，具有良好的应用前景。

随着植物基因工程的迅速发展，转化方法也在不断的完善，为后期广泛深入的研究提供了实验基础。目前将外源基因导入受体细胞的方法主要包括农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法、组织电击法、PEG法等。其中以农杆菌介导的遗传转化方法应用最为广泛。农杆菌中含有Ti质粒，Ti质粒的T-DNA区能够向植物中转移并且整合到植物的基因组中。常用的几种植物实验材料包括烟草、拟南芥等都是通过将植物组织材料浸入农杆菌重悬液这种方法进行转化；花生、高粱等物种利用超声波法辅助农杆菌介导的转基因；非洲菊、棉花等物种通过真空渗透法提高农杆菌介导的转化效率。对于高山离子芥也有相关的探索实验，但是转化效率低且不稳定，并且没有相关实验证明转化后的基因能够在植株中稳定表达。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种高效的高山离子芥转基因植株的制备方法。

所述的高山离子芥转基因植株的制备方法是在常用的农杆菌侵染的基础上，调整农杆菌和乙酰丁香酮的浓度，并创造性的通过施加外源压力，得到了高效稳定且简便省时的高山离子芥转化方法。

本发明提供了一种高效的高山离子芥转基因植株的制备方法，通过以下技术方案实现：

(1)载体构建

首先克隆GUS基因，通过gateway的方法构建到目的载体PMDC32上，形成PMDC32-GUS融合表达载体，如图1所示。

(2)农杆菌转化

将构建好的PMDC32-GUS载体电击转化农杆菌GV3101。将转化成功的农杆菌接菌于YEP培养基上，230rpm摇菌16-20h，至OD值＝1.4左右，2500rpm离心8min，去上清得农杆菌菌体。加入适量的MS液体重悬液分别稀释农杆菌浓度至OD值＝0.4、0.6和0.8，并且在不同OD值的重悬液中分别加入0μM、50μM、100μM和150μM乙酰丁香酮备用。

优选地，YEP培养基含有50mg/L卡那霉素，20mg/L利福平和30mg/L庆大霉素；

优选地，所述用于步骤(3)侵染的转化后的农杆菌浓度范围为OD＝0.8(6.4×10⁸cells/ml)；

优选地，所述转化后的农杆菌加入乙酰丁香酮浓度为0-150μM。

优选地，所述转化后的农杆菌加入乙酰丁香酮浓度为50μM。

(3)农杆菌介导的压力侵染