[发明专利]一种鸡Nrf2蛋白抗体及其免疫原、免疫原性多肽、检测试剂盒和应用

权利要求书

1.一种用于获得鸡Nrf2蛋白抗体的免疫原，其特征在于，是由氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示的多肽通过偶联剂与载体蛋白偶联获得的。

2.一种鸡Nrf2蛋白抗体，其特征在于，是以权利要求1所述的免疫原与佐剂混合乳化后免疫接种兔，取免疫后兔的血液经纯化后制备获得的,具体方法如下：

1)制备免疫原：将氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的多肽，通过偶联剂与载体蛋白偶联，得到鸡Nrf2免疫原；

2)免疫接种：将步骤1)获得的鸡Nrf2免疫原与佐剂混合乳化后，接种兔进行免疫；

3)在接种一个月后，参照首次免疫使用的剂量减半进行二次免疫；

4)制备粗抗体：二次免疫一个月后，在无佐剂条件下静脉注射鸡Nrf2免疫原，注射剂量为0.1-1mg/只，此后，每隔两周进行加强免疫，累计加强免疫2-5次，每次加强免疫1周后取兔血进行离心，收集上清液，获得鸡Nrf2蛋白粗抗体；

5)纯化抗体：将氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的多肽偶联到柱中预先活化的巯基蛋白琼脂糖偶联树脂上制备抗原亲和柱，然后用PBS缓冲液进行柱平衡；将过滤后的鸡Nrf2蛋白粗抗体加入平衡后的抗原亲和柱，而后用PBS缓冲液再次进行柱平衡，经洗脱后制备获得鸡Nrf2蛋白抗体。

3.权利要求2所述的鸡Nrf2蛋白抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)制备免疫原：将氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的多肽，通过偶联剂与载体蛋白偶联，得到鸡Nrf2免疫原；

2)免疫接种：将步骤1)获得的鸡Nrf2免疫原与佐剂混合乳化后，接种兔进行免疫；

3)在接种一个月后，参照首次免疫使用的剂量减半进行二次免疫；

4)制备粗抗体：二次免疫一个月后，在无佐剂条件下静脉注射鸡Nrf2免疫原，注射剂量为0.1-1mg/只，此后，每隔两周进行加强免疫，累计加强免疫2-5次，每次加强免疫1周后取兔血进行离心，收集上清液，获得鸡Nrf2蛋白粗抗体；

5)纯化抗体：将氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的多肽偶联到柱中预先活化的巯基蛋白琼脂糖偶联树脂上制备抗原亲和柱，然后用PBS缓冲液进行柱平衡；将过滤后的鸡Nrf2蛋白粗抗体加入平衡后的抗原亲和柱，而后用PBS缓冲液再次进行柱平衡，经洗脱后制备获得鸡Nrf2蛋白抗体。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述偶联剂为4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐、N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯或戊二醛；所述载体蛋白为玥孔戚血蓝蛋白、卵清蛋白、牛血清白蛋白或人工合成的多聚赖氨酸。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述免疫接种是将0.25-1.5mg免疫原与0.05-0.5mg胞壁酰二肽佐剂混合后，加PBS定容至1mL，然后与等体积弗氏完全佐剂混合乳化后接种兔；所述兔为两月龄雌性新西兰白兔；所述接种部位为兔两侧腹股沟和腋下四点及颈背部四点皮下；接种剂量为0.1-1mg免疫原/只。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤5)所述洗脱是指用pH2.5的100mM甘氨酸溶液作为抗体洗脱液对抗原亲和柱进行洗脱，合并收集280nm波长处吸光度大于1.0的洗脱液，以PBS缓冲液为透析液进行透析，获得所述鸡Nrf2蛋白抗体。

7.一种检测鸡Nrf2蛋白的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述ELISA检测试剂盒组分包括酶标板、包被缓冲液、封闭液、酶标二抗、TMB显色液、终止液、检测抗原和权利要求2所述的鸡Nrf2蛋白抗体，所述检测抗原是以戊二醛为偶联剂，将氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的多肽与牛血清白蛋白偶联制备获得的。

8.根据权利要求7所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述包被缓冲液为pH9.6的50mM碳酸盐包被缓冲液；所述封闭液为质量分数为1％的BSA溶液；所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体Fc段二抗；所述终止液为2M的硫酸水溶液。