[发明专利]聚乙二醇化蛋白类药物的平均修饰度测定方法

说明书

本发明公开了一种聚乙二醇化蛋白类药物的平均修饰度测定方法，包括如下步骤：(1)使用与未修饰蛋白类药物标准品、聚乙二醇标准品的浓度呈线性关系的多种类型的检测器，分别建立未修饰蛋白类药物标准品、聚乙二醇标准品的浓度与其各自浓度对应的每种类型检测器响应值的标准曲线；(2)检测聚乙二醇化蛋白类药物的响应值；(3)根据标准曲线计算聚乙二醇化蛋白类药物中聚乙二醇、蛋白的含量；(4)计算聚乙二醇化蛋白类药物的平均修饰度。该方法可直接检测PEG修饰蛋白中的蛋白和PEG的量来确定PEG的修饰度，克服现有技术受外界干扰大的缺陷，具有准确性高、重现性好、通用性强、可标准化的特点。

技术领域

本发明涉及生物医药检测领域，具体涉及一种聚乙二醇化蛋白类药物的平均修饰度测定方法。

背景技术

蛋白质类药物主要包括多肽、酶、细胞因子、激素、抗体等一些具有特殊功能的蛋白质，随着生物技术的发展，人们可以通过发酵工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程等途径获得所需的蛋白质。但经过大量的临床研究发现，未经任何修饰的蛋白类药物在体内具有半衰期短、免疫原性强、稳定性差、易被体内酶降解等缺陷，从而降低了临床效果。为此，人们尝试通过多种途径对蛋白类药进行改造以适应于临床应用。

聚乙二醇(PEG)是重复化学结构[HO-(CH2-CH2-O)n-H]的多聚物，PEG分子中存在大量乙氧基能够与水形成氢键，具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动力学体积，能够改变药物在水溶液中生物分配行为和溶解性。自1970s起，因其低毒性、良好的生物相容性和两亲性被广泛应用于生物医药、食品和化妆品中，PEG是经美国食品药品监督管理局(FDA)批准的极为少数的可作为体内注射药用的聚合物之一。蛋白类药物经过聚乙二醇修饰后，可延长蛋白类药物在体内的半衰期，减少给药次数；增大蛋白类药物分子量，减少肾小球清除；降低了蛋白酶对蛋白类药物的降解作用；PEG与蛋白类药物间的化学键在体内需要时间水解，由此可减缓蛋白类药物的释放；屏蔽药物的抗原位点，降低免疫原性；增加药物的稳定性和溶解性。1991年，第一种用聚乙二醇修饰的蛋白药物PEG腺苷脱氨酶(Pegademase)获得FDA批准上市，用于治疗儿童免疫缺陷症。目前已有多种PEG修饰蛋白药物应用于临床，同时还有更多正处于临床研究阶段。

2000年以后上市的PEG修饰蛋白药物

PEG偶联至蛋白上后，需对蛋白上结合了多少PEG进行质量控制。目前，PEG平均修饰度的检测方法主要有：三硝基苯磺酸(TTBS)法、荧光胺法、质谱法、液相色谱法、毛细管法、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、拉曼散射光谱、酶解法等。TNBS法和荧光胺法都属于传统的平均修饰度检测法，1966年，Habeeb首次采用三硝基苯磺酸(TNBS)与蛋白表面的赖氨酸ε-氨基发生反应，反应生成物三硝基苯(TNP)在375nm除有特征吸收。该方法可以通过测得的自由氨基间接计算出蛋白质的PEG修饰度，简单易行，但影响因素多，受外界干扰大、重复性较差、测定值较理论值偏高。Stock等采用荧光法代替TNBS法来测定PEG修饰蛋白的平均修饰度。荧光胺与蛋白质表面赖氨酸ε-氨基发生反应，反应产物可产生荧光，通过测定激发荧光强度，可以计算其平均修饰度。该方法较TNBS法灵敏度高，不受PEG的干扰，但易受还原物质的干扰，且荧光胺与蛋白质的反应快速，变异性较大，测定值较理论值偏低。Foser等采用MALDI-TOP测定了PEG-干扰素的平均修饰度，Bullock等测定了PEG-SOD的平均修饰度，该方法对PEG单修饰蛋白的测定准确、直观，但该方法用于随机多位点修饰蛋白测定时，易出现带双电荷或者多电荷的离子，其测定准确度会受到影响，同时质谱法仪器昂贵，不具有通用性。酶解法是指通过酶将PEG释放出游离的PEG，然后检测游离PEG进行推算PEG结合量，该方法缺陷在于酶解可能释放PEG不完全，受游离PEG干扰，不能直接检测修饰样品，需对修饰样品需进行纯化去除游离PEG，因而不具有通用性。

发明内容