[发明专利]发根农杆菌介导的桃根系稳定转化方法及其应用

说明书

本发明公开了一种发根农杆菌介导的桃根系稳定转化方法及其应用，涉及桃生物技术和分子育种领域。本方法是：①无菌实生苗培养；②转化受体材料外植体制备；③侵染菌液制备；④侵染；⑤共培养；⑥转基因根诱导培养；⑦转基因根检测；⑧复合型桃植株获得。本方法的应用是：①获得含重要农艺性状基因的转基因根+野生芽复合型桃植株；②进行桃根结线虫抗性改良研究；③进行桃根系干旱、盐碱的胁迫抗性研究。本发明不仅可以获得转基因根+野生芽复合型桃植株，而为今后开展桃根系病虫害及抗性育种研究提供了重要的技术支撑。

技术领域

本发明涉及桃生物技术和分子育种领域，尤其涉及一种发根农杆菌介导的桃根系稳定转化方法及其应用；具体地说，发根农杆菌介导的桃转化方法体系建立为开展桃耐盐碱，抗重金属毒害、抗涝、抗线虫等方面的研究及加强桃抗性育种奠定了基础。

背景技术

植物转基因技术是将感兴趣的外源基因转入植物的基因组上，以获得含目标性状植株的方法，其主要应用于植物性状分子机理基础研究和植物品种改良以及新品种培养等方面。目前，一些重要的农作物如棉花、大豆、水稻和苹果等通过转基因技术改良已获得了具有高产、高抗、多抗和高品质等优良性状的转基因新品种，为推动未来农业的发展奠定了基础。

桃是多年生类重要的核果果树，基因组大小230Mb，约为拟南芥基因组大小的两倍，其稳定转化工作难度较大，严重阻碍了桃的分子遗传改良研究进程。目前仅有少量文献报道桃的农艺性状探索研究，尚无高效稳定的转基因体系建立公布。另外，转基因植物通常是利用农杆菌介导离体外植体进行转化获得转基因植株。农杆菌有两种，一种是根癌农杆菌，该类型的菌株被广泛地用于转基因植株的获得；另一种是发根农杆菌，主要是用于转基因根的获得。通过总结前人的研究发现，利用根癌农杆菌介导桃外植体转化极难获得桃转基因材料。因此，建立高效稳定的转化体系已成为当前致力于桃农艺性状基础研究和分子遗传改良研究迫切待解决的技术难题。

发明内容

本发明的目的在于攻克桃稳定转化难的技术瓶颈，提供一种一种发根农杆菌介导的桃根系稳定转化方法及其应用，即利用发根农杆菌介导桃芽段外植体稳定转化获得转基因根+野生型芽桃复合型株系的体系建立。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

通过将目的基因插入表达载体，利用发根农杆菌的侵染实现外源基因向植物体细胞的转移和整合，将外植体培养在无激素的筛选培养基上筛选培养，被菌液侵染的伤口处先形成瘤状组织，再分化形成根，在体视荧光显微镜下观察红色荧光蛋白激发的荧光，确定转基因根。该方法操作简单，周期短，从侵染到转基因根的获得仅需1个月时间即可获得转基因根+野生型芽桃复合型株系，因此该方法适用于针对桃根病害及抗耐性方面的研究。

一、发根农杆菌介导的桃芽段株稳定转化方法

本方法包括下列步骤：

①无菌实生苗培养

A、收集以枣油桃7成熟果实，去除果肉，用20％的商业化漂白剂浸泡 30min后，去除漂白剂，风干桃核，4℃保存2个月；

B、4℃取出桃核，去除内果皮，在超净台上，将枣油桃种子置于烧杯中，用75％的酒精消毒种子30s和20％商业化漂白剂附加0.02％Tween-20混合消毒液搅拌器浸泡25min后，无菌水润洗6-8次，将种子置于新的装有ddH2O的无菌瓶中过夜；

C、在超净台上，用无菌刀片去除种皮，将种子接种在1/2MS+0.05mg/L IBA+0.5mg/L 6-BA发芽培养基，培养基pH 5.8，25±1℃，黑暗条件培养 15d；实生苗茎段长10cm后，移至25±1℃，16h光照，8h黑暗的光周期条件下生长10d，叶片完全舒展和变绿；

②转化受体材料外植体制备

将约1.5cm长的芽段外植体从无菌苗上切割下来作为转化用的受体材料，切口斜切，以增加菌与伤口的接触面积；