[发明专利]一种用于诱导性多能干细胞定向分化小梁网细胞的培养体系

说明书

本发明提供了一种用于诱导性多能干细胞定向分化小梁网细胞的培养体系，所述培养体系包括第一阶段诱导分化培养基和第二阶段诱导分化培养基；所述第一阶段诱导分化培养基由基本培养基添加TGF‑beta1、NGF‑bet和Erythropoietin制备得到；所述第二阶段诱导分化培养基由基本培养基添加TGF‑beta1、NGF‑beta、Erythropoietin、PGF2alpha和EGF制备得到；所述基本培养基为含血清替代品的MEM‑alpha培养基。通过定向诱导分化培养体系诱导分化的细胞与原代小梁网细胞极其相似，满足了干细胞治疗青光眼的临床要求；同时该培养体系中不存在外来物种以及同种其他个体的“污染”，是一种稳定、有效且不存在污染的定向诱导分化体系。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种用于诱导性多能干细胞（iPSCs）定向分化小梁网细胞的培养体系。

背景技术

青光眼是由视网膜神经节细胞的凋亡导致视觉损失的一类眼科疾病。高眼压被认为是青光眼最重要的致病因素。高眼压是由房水产生与外排的失衡导致。外排途径主要包括小梁网途径和葡萄膜巩膜途径，其中，80-90%的房水外排阻力来源于小梁网途径。随着病理学进程的发展，小梁网细胞的数目会显著降低，进而难以维持正常房水外排功能。伴随着诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）的出现，利用自体来源的iPSCs重塑小梁网组织成为新型治疗青光眼的手段。本课题组前期已发表的工作证明，利用人原代小梁网细胞的条件培养基，可有效将人或鼠的iPSCs定向诱导分化为小梁网细胞（iPSC-TM）。 此类小梁网细胞无论从转录水平还是翻译水平，表达大量小梁网细胞相关蛋白，包括TIMP3， LAMA4，ColIV, AQP1, Myocilin等。此类细胞具备细胞吞噬能力，地塞米松诱导后Myocilin的高表达和形成cross-linked actin network等能力。 本课题的前期研究足以证明此类iPSC-TM细胞具备小梁网细胞的基本功能，基本满足干细胞治疗青光眼的要求。

尽管人原代小梁网细胞条件培养基具备定向诱导分化iPSCs的能力，然而此项技术存在以下几点缺陷：（i）来源于不同原代小梁网细胞的条件培养基的诱导分化效率不同；（ii）条件培养基中存在外来物种的“污染”（胎牛血清）及同种其他个体的“污染”（不同人的原代小梁网细胞分泌物），致使此类培养基无法应用于临床。

发明内容

针对上述存在的问题，本发明的目的是提供一种用于诱导性多能干细胞（iPSCs）定向分化小梁网细胞的培养体系。通过定向诱导分化培养体系诱导分化的细胞与原代小梁网细胞极其相似，满足了干细胞治疗青光眼的临床要求；同时该培养体系中不存在外来物种以及同种其他个体的“污染”，是一种稳定、有效且不存在污染的定向诱导分化体系。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种用于诱导性多能干细胞（iPSCs）定向分化小梁网细胞的培养体系，包括第一阶段诱导分化培养基和第二阶段诱导分化培养基；

所述第一阶段诱导分化培养基由基本培养基添加转化生长因子-β （TGF-beta1）、神经生长因子-β （NGF-bet）和红细胞生成素（Erythropoietin）制备得到；

所述第二阶段诱导分化培养基由基本培养基添加转化生长因子-β （TGF-beta1）、神经生长因子-β （NGF-beta）、红细胞生成素（Erythropoietin）、前列腺素F2α（PGF2alpha）和表皮细胞生长因子（EGF）制备得到；

所述基本培养基为含血清替代品（knockout serum replacement）的MEM-alpha培养基。

进一步的，所述基本培养基中knockout serum replacement的含量为5%-15%。