[发明专利]一种微藻细胞壁突变体的筛选方法

说明书

一种微藻细胞壁突变体的筛选方法，所述方法是利用带有荧光标记的凝集素专一性来标记藻细胞表面的糖，同时配合使用流式细胞仪，将凝集素标记的具有特定性状的藻细胞壁突变体筛选出来，以获得微藻细胞壁突变体。本发明建优化了筛选的关键影响因素和条件，从而实现较高的筛选效率和较好的可重复性，以便通过基因工程手段和生物技术对特征藻种进行筛选，开发更有研究和经济价值的微藻，如小球藻、衣藻和雨生红球藻等。

技术领域

本发明涉及细胞筛选技术领域，尤其是一种微藻细胞壁突变体的筛选方法。

背景技术

微藻因具有生产大量的高附加值化合物的潜力，而被广泛应用和研究，其中微藻细胞壁在抵抗逆境和细胞破碎过程中的影响至关重要。

微藻细胞壁的破裂效率严重影响着微藻副产物的产率，微藻细胞壁如衣藻、小球藻和雨生红球藻主要由糖类组成，如果细胞壁的某种糖发生改变，可能会改变细胞壁的结构，使细胞壁变薄或更易打破，从而改善收获效率。因而，筛选获得具有某种特性的微藻细胞壁突变体，将有利于微藻的产业化应用。

目前已有大量研究表明，真菌侵入植物和藻类细胞首先需要识别并穿透细胞壁，病原真菌是通过凝集素-糖结合模式如通过纤维素结合结构域来识别宿主细胞壁上的纤维素，并释放多种能够降解宿主细胞壁的多糖水解酶如纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶来打破壁垒，同时利用水解产物如葡萄糖作为碳源进行生长。

另外，凝集素-糖专一性结合在藻类-真菌的共生体系中以及真菌感染动物细胞中起着非常重要的作用，也是一些病毒、细菌和原生动物识别宿主的方式。例如，凝集素和糖的相互作用是地衣Xanthoriaparietina和Erniaprunastri中真菌和藻类共生的识别模式，共生藻细胞表面的糖基化尿素酶（glycosylated urease）能结合真菌释放的具有凝集素功能的精氨酸酶（arginase），阻止精氨酸酶进入藻细胞从而较少细胞中精氨酸转化为腐胺，降低藻细胞的腐胺水平和毒性影响，从而形成共生体系。引起世界各地两栖类的大量死亡的壶菌Batrachochytriumdendrobatidis（http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/batrachochytrium_dendrobatidis/MultiHome.html），其基因组中存在类似凝集素功能的CBMs结构域, 可能同其他病原真菌一样，它表达的蛋白能结合壶菌细胞壁上的几丁质而使其不被宿主细胞的几丁质酶降解，从而保持其侵染性。转录组学的数据也表明真菌在侵染线虫时大量表达包含糖结合结构域WSC和Ricin-B凝集素结构域的转录子。可见，细胞表面的糖类往往都能对应结合一种特定的凝集素或类似凝集素功能物。尽管如此，目前并未见到将凝集素标记应用到微藻细胞壁突变体筛选中的相关报道，而筛选的方法和优化条件也未见记载。

流式细胞仪（Flow cytometry）可以逐个快速测量悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的物理或化学特征参数，如细胞大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等，并可以根据预选的参数范围把指定的细胞亚群从中分选出来。但由于受到特定标记物的限制，目前流式筛选技术主要应用于医学领域来筛选动物细胞。

发明内容

（一）要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种微藻细胞壁突变体的筛选方法，所述方法利用带有荧光标记的凝集素专一性来标记藻细胞表面的糖，同时配合使用流式细胞仪，将凝集素标记的具有特定性状的藻细胞壁突变体筛选出来，以获得具有某种特性的微藻细胞壁突变体。

此外，本发明还对筛选的关键影响因素和条件进行优化，从而实现较高的筛选效率和较好的可重复性，以便通过基因工程手段和生物技术对特征藻种进行筛选，开发更有研究和经济价值的藻株。

（二）技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：