[发明专利]基于i-motif构型变化的末端转移酶电化学生物传感器制备方法及应用

说明书

本发明公开了基于i‑motif构型变化的末端转移酶电化学生物传感器制备方法及应用，具体步骤如下：首先将巯基DNA探针固定到处理好的裸金电极，然后滴加巯基乙醇处理以置换电极表面非Au‑S键固定的捕获探针。随后向电极上滴加配制的TdT反应液，在37℃下放置1h。冲洗电极后，在电极表面滴加银离子溶液，室温孵育一段时间后再滴加龙胆紫溶液，室温孵育一段时间得到传感器，于PBS(0.1M，pH7.0)电解质溶液中检测其电化学响应。优点是特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低。

技术领域

本发明涉及一种电化学生物传感器及其检测方法，尤其是涉及基于i-motif构型变化的末端转移酶电化学生物传感器制备方法及应用，属于功能生物材料和生物传感技术领域。

背景技术

脱氧核苷酸末端转移酶(TdT)是一种不需模板就可以催化脱氧核苷酸结合到DNA分子3’-OH的DNA聚合酶。相关研究表明TdT在生物体系中的活性随着组织细胞异常而变化，可以通过检测特定组织细胞中TdT含量从而对某些疾病进行诊断及治疗。传统TdT检测方法主要依靠凝胶电泳分析，但凝胶电泳分析操作过程复杂、耗时长、费用昂贵、重现性较差，且只能给出半定量的结果。近几年，涌现了一些生物传感体系用于TdT活性检测，到目前为止仍然拥有较大的研究空间和意义。因此，开发一种简便、灵敏、低成本、选择性好的TdT检测手段势在必行。

富含胞嘧啶(C)的DNA分子在酸性条件下通过质子化的C碱基和非质子化的C碱基形成C-CH⁺碱基对，反向平行排列的C-CH⁺碱基对交替排列和互相嵌入形成稳定的平行双螺旋链，两条双链因为氢键形成四螺旋结构，即i-motif结构。在室温及中性条件下，银离子(Ag(I))嵌入C碱基形成C-Ag(I)-C复合物，诱导富C DNA分子形成i-motif结构。研究表明在化疗、调控基因转录时，i-motif是一种引人注意的药物目标分子，并且在纳米技术上具有很大的应用潜力，i-motif结构引起研究者的浓厚兴趣。目前，还没有发现基于i-motif构型变化的TdT生物传感体系研究，具有较大的应用前景。

本发明基于i-motif构型变化设计了末端转移酶电化学生物传感器制备方法及应用，该传感器利用TdTT具酶作用，将三磷酸胞嘧啶核苷(dCTP)引入DNA引物3’-OH端，形成富C长链，嵌入Ag(I)后形成C-Ag(I)-C复合物介导的i-motif结构。龙胆紫(GV)是一种三苯基甲烷类染料，能够堆叠到i-motif结构表面产生电化学信号，本发明通过TdT活性变化调节富C链的长度，影响i-motif形成，进而影响嵌入GV的量，利用电化学信号改变来实现TdT活性检测及其抑制剂的筛选。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低的基于i-motif构型变化的末端转移酶电化学生物传感器制备方法及应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：基于i-motif构型变化的末端转移酶电化学生物传感器制备方法及应用，具体步骤如下：

(1)传感器制备

a.Electrode 1的制备

将2.5～7.5μL浓度为0.1～1μM的巯基DNA探针溶液滴加到干净且活化好的裸金电极(标记为Au)表面，4℃冰箱放置8～16h，再用0.1～1.0mM巯基乙醇(MCH)处理20～60min，通过MCH与Au表面的Au-S共价结合而置换电极表面非Au-S键固定的捕获探针，蒸馏水缓缓冲洗电极，标记为Electrode 1。

b.Electrode 2的制备