[发明专利]一种凝结芽孢杆菌的产孢方法

说明书

本发明涉及一种凝结芽孢杆菌的产孢方法，包括如下步骤：菌种的活化、种子液的制备及发酵及发酵过程控制。本发明主要以残糖为指导参数，在不同阶段通过调整底物浓度大幅度提高营养细胞产量，发酵后期通过添加促孢因子，调整发酵过程参数，提高成孢率，营养细胞可达5.01×10¹⁰cfu/m或以上，产孢率90％以上。此方法简单方便，有利于工业化生产，为益生菌工业化，规模化，提供了一定借鉴。

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种通过补糖工艺及促孢因子的添加，最终实现凝结芽孢杆菌营养细胞的高密度发酵并提高产孢率的凝结芽孢杆菌的产孢方法。

背景技术

凝结芽孢杆菌是一种兼备芽孢菌产生孢子，及乳酸菌产酸能力的特殊功能性益生菌，在自然界中分布广泛。该菌株能够产生乳酸，属于同型乳酸发酵；同时该菌株属于芽孢杆菌属，能产生具有强耐受性的休眠孢子体。因此，凝结芽孢杆菌既具有芽孢杆菌的特点，同时还具有乳酸菌的优势。凝结芽孢杆菌既可以产生大量的代谢产物，如凝固素，L-乳酸等，增加动物体对矿物质及营养元素的降解吸收，调节肠道菌群结构，增加肠道益生菌数量，提高动物体免疫力，还能够通过产生蛋白酶，淀粉酶，纤维素酶等胞外代谢产物，改善饲料营养成分，提高饲料转化率。同时，由于其对胃酸，胆盐的抗性，使得其能够通过动物体胃消化过程，到达结肠，盲肠，并定植，在肠道内通过代谢，产生抑菌物质，抑制有害微生物的生长繁殖，基于上述优势，凝结芽孢杆菌在饲料添加剂中的使用越来越受到学者的关注。

在生物技术转化过程中，低成本化，规模化，工业化，是面临的主要问题，如何利用低成本的原料生产出大批量的菌体或者代谢产物，成为研究的热点。本发明针对凝结芽孢杆菌大规模工业化过程中遇到的问题，通过对发酵培养基成分及发酵过程工艺控制的摸索，实现了凝结芽孢杆菌营养细胞与孢子的高密度发酵，为凝结芽孢杆菌工业化生产提供了借鉴。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于，提供一种凝结芽孢杆菌的产孢方法。

为了达成上述的目的，本发明采用了如下技术方案：

一种凝结芽孢杆菌的产孢方法，包括如下步骤：

1)将凝结芽孢杆菌菌吸取到固体营养琼脂培养基，划线，35℃-45℃条件下培养24-36h，挑取平板单菌落于斜面培养基，35-45℃培养12-24h后获得斜面培养物；

2)使用1-3ml无菌生理盐水冲洗斜面培养物菌苔，以0.1-0.7％(v/v)的接种量接种于种子培养基，35-45℃，转速160-320rpm/min，培养16-30h后获得种子培养液；

3)将培养好的种子培养液以3.0-7.0％(v/v)的接种量接种于装有35L发酵培养基的50L发酵罐中，进行发酵，之后添加促孢因子，收获营养细胞及孢子。

进一步地，其中步骤1)中，所述凝结芽孢杆菌是从-70℃保藏的甘油管中吸取的凝结芽孢杆菌菌悬液。

进一步地，其中步骤2)中，所述种子培养基的各成分为:葡萄糖10-40g/L，蛋白胨5.0-15g/L，酵母粉1.0-5.0g/L，NH₄Cl 0.5-1.5g/L，MgSO₄ 0.1-0.3g/L，CaCO₃ 0.5-2.0g/L，pH7.0-8.0。

进一步地，其中步骤3)中，所述发酵的初始pH值为7.5-8.5，转速为150-250rpm/min。

进一步地，其中步骤3)中，当所述发酵培养基中残糖下降至0.1-0.5g/L以下时，补加葡萄糖至终浓度8-12g/L。

进一步地，其中步骤3)中，促孢因子的添加时间为发酵14-20h后，添加所述促孢因子后，发酵温度调至35-45℃，转速调整至250-300rpm/min，发酵24-36h后收获营养细胞及孢子。