[发明专利]携带FGF-1基因慢病毒表达质粒的构建方法在审
| 申请号： | 201910082476.7 | 申请日： | 2019-01-28 |
| 公开（公告）号： | CN109609555A | 公开（公告）日： | 2019-04-12 |
| 发明（设计）人： | 郭建军;田莹;檀军;赵帅;郑玉林;陈緖美;尹志勇 | 申请（专利权）人： | 贵州大学 |
| 主分类号： | C12N15/867 | 分类号： | C12N15/867;C12N15/12 |
| 代理公司： | 贵阳中新专利商标事务所 52100 | 代理人： | 李亮;程新敏 |
| 地址： | 550025 贵州省贵*** | 国省代码： | 贵州;52 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基因 构建 慢病毒表达质粒 氨苄西林 重组质粒 嘌呤霉素 嘌呤霉素抗性基因 红色荧光蛋白 重组质粒转染 筛选 多克隆位点 抗肿瘤药物 生物学特性 荧光显微镜 坚实基础 抗性基因 阳性细胞 原核表达 真核表达 携带 细胞株 研发 质粒 转染 标签 细胞 观察 研究 | ||
1.一种携带FGF-1基因慢病毒表达质粒的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)FGF-1基因的扩增；
2)将FGF-1基因与载体pLenti-Mcherry-Puro连接，构建重组慢病毒表达质粒pLenti-CMV-FGF-1-Emcherry-Puro；
3)将重组慢病毒表达质粒pLenti-CMV-FGF-1-Emcherry-Puro与慢病毒包装质粒psPAX2及pVSV-G共转染293T细胞，48h后，收集上清，72000×g离心4h获得高度浓缩的慢病毒颗粒；
4)将包装好的重组慢病毒CMV-mcherry-LVP转染293T细胞，通过嘌呤霉素筛选阳性细胞株，对阳性细胞株进行细胞免疫荧光鉴定，获得稳定表达FGF-1蛋白细胞株。
2.根据权利要求1所述的携带FGF-1基因慢病毒表达质粒的构建方法，其特征在于：所述的步骤1)具体是，以FGF-1-F和FGF-1-R为特异性引物，添加酶切位点Not I和Avr II，以质粒pEmcherry-N1-FGF-1为模板，进行PCR扩增；所述的特异性引物FGF-1-F的序列如序列表SEQ ID 1所示，FGF-1-R的序列如序列表SEQ ID 2所示。
3.根据权利要求2所述的携带FGF-1基因慢病毒表达质粒的构建方法，其特征在于：所述的PCR扩增体系为：PCR反应程序：94℃变性2min，56℃复性1min，72℃延伸2min，共循环30次，最后72℃再延伸10min。PCR结束后，取2μl扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，分离、回收纯化。
4.根据权利要求1所述的携带FGF-1基因慢病毒表达质粒的构建方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的病毒包装质粒是psPAX2和pVSV-G。
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