[发明专利]一种提高茶园土壤有效氮的微生物固定化剂及其制备方法

权利要求书

1.一种提高茶园土壤有效氮的微生物固定化剂的制备方法，其特征在于：所述微生物固定化剂包括氮素转化菌、吸附材料和包埋剂，三者依序按质量比重为8：1：400，所述的微生物固定化剂含活菌数1.0×10⁷-1.0×10⁸ cfu/g；制备方法包括以下步骤：

1）、氮素转化菌的获取：取10g土样放入锥形瓶，向锥形瓶加入90 mL的含100毫mol浓度铝离子的无菌水稀释，震荡过夜得到土壤悬浮液，用1 mL无菌移液管吸取所述土壤悬浮液到9 mL无菌水试管中稀释，依此方法稀释分别获得10²、10³和10⁴倍的稀释液，分别取所述10²、10³和10⁴倍的稀释液100μL涂布于酪素固体培养基处，且28℃培养3-4天，之后分离出其中生长较好的菌株进行纯化后转接于阿须毕无氮培养基中，再28℃培养3-4天后，选取其中生长较好的菌株即为氮素转化菌；

2）、氮转化菌的培养：将步骤1）所得的氮素转化菌接种于液体培养基中，于28-30℃培养2-3天，此时菌落形成单位≥1×10⁹个/mL；

3）、包埋剂的制备：取质量比为0.5-1:2的海藻酸钠和琼脂，煮沸溶解后获得混合液，再将该混合液与30%的甘油按照体积比100:1混合，搅拌均匀后形成包埋剂；

4）、微生物固定化剂的制备：将吸附材料添加到步骤2）所得的氮转化菌的菌液中进行12小时吸附，获得吸附菌悬液；然后加入到冷却至40℃的步骤3）中所得的包埋剂中；吸附菌悬液与包埋剂的体积比为1：25-50，搅拌均匀；之后，取4%的 CaCl₂溶液，与饱和硼酸溶液混合后形成组成溶液，将搅拌均匀的吸附菌悬液与包埋剂的混合溶液再和所述组成溶液进行交联，交联时间为24-36h，将所得的圆形颗粒状的产物按质量比1：2放于液体培养基中，于28-30℃培养2天，即得到微生物固定化剂。

2.根据权利要求1所述的一种提高茶园土壤有效氮的微生物固定化剂的制备方法，其特征在于：所述的吸附材料为活性炭，所述的包埋剂包括海藻酸钠、琼脂和甘油。

3.根据权利要求1所述的一种提高茶园土壤有效氮的微生物固定化剂的制备方法，其特征在于：将酪蛋白、牛肉浸粉、氯化钠、磷酸氢二钾、溴百里香酚兰、琼脂和蒸馏水，依次按照质量比为10：3：5：2：0.05：15：1000的配比混合后，经121℃高温灭菌20 min，即可获得步骤1）中所述的酪素固体培养基。

4.根据权利要求1所述的提高茶园土壤有效氮的微生物固定化剂的制备方法，其特征在于：将甘露醇、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、氯化钠、二水合硫酸钙、碳酸钙、琼脂和蒸馏水，依次按照质量比为10：0.2：0.2：0.2：0.2：2：15：1000的配比混合后，经121℃高温灭菌20min，即可获得步骤1）中所述阿须毕无氮培养基。

5.根据权利要求1所述的提高茶园土壤有效氮的微生物固定化剂的制备方法，其特征在于：将葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨、七水合硫酸镁和蒸馏水，依次按照质量比为10：5：0.5：0.2：1000的配比混合后，即可获得步骤2）和4）中所述的液体培养基。