[发明专利]基于破坏革兰氏阴性菌外膜蛋白组装复合物BAM的抗菌多肽

说明书

本发明公开了基于破坏革兰氏阴性菌外膜蛋白组装复合物BAM的抗菌多肽，所述抗菌多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，分别命名为BamA‑h7，BamD‑h7；或者所述抗菌多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列具有至少70%的同源性。在BamA‑h7或BamD‑h7的氨基端融合上能特异性穿透细胞膜的导肽，导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，融合多肽BamA‑h7的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；融合多肽BamD‑h7的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。实验结果显示，在两段多肽的前端偶联上能特异性穿透细胞膜的导肽，融合后能直接进行杀菌。本发明提供的两种多肽以及含有导肽的两种融合多肽都具有优异的杀菌性能。

技术领域

本发明属于生物化学领域中的多肽药物技术领域，具体涉及基于破坏革兰氏阴性菌外膜蛋白组装复合物BAM的抗菌多肽。

背景技术

自青霉素的问世到如今，抗生素一直以来都是人类对抗细菌感染疾病的首选药物。但几十年以来，临床抗生素的频繁使用以及各种抗生素的不正常使用导致全球范围内耐药菌出现的频率大大增加，而每年死于耐药细菌感染的人数也在持续的增加。

阳离子抗菌肽是自然界天然进化而成、具有抗致病微生物感染的生物活性大分子，存在于不同物种的免疫系统内，长度较短一般为10-80个氨基酸。其结构特征为：①携带正电荷，富含碱性氨基酸，此特性被认为是与抗菌肽结合携带负电荷的细菌细胞膜结构有关。②二级结构通常为α螺旋结构。③具有两亲性。阳离子抗菌肽可以通过与细胞内的靶点特异性结合来对细菌产生影响最终导致细菌死亡。而细菌较难通过靶点的突变对抗菌肽产生耐药，因此抗菌肽有希望成为临床治疗重症耐药细菌感染的新型抗生素。

发明内容

本发明的目的在于提供基于破坏革兰氏阴性菌外膜蛋白组装复合物BAM的抗菌多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，或者其氨基酸序列与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列具有至少70%的同源性。

本发明根据大肠杆菌中诸多外膜蛋白都需要通过外膜上的BAM桶蛋白折叠系统来完成修饰和安插到外膜上正确位置的机制，根据文献《 Structural basis of outermembrane protein insertion by the BAM complex》中对BAM桶蛋白系统的介绍得知该蛋白系统有五个蛋白质亚基分别为A、B、C、D、E且该系统具有两种构型BamABCDE和BamACDE，而在两种构型中BamA和BamD为必不可少的蛋白质亚基，针对这两种蛋白质亚基设计了七种能与之结合的特异性多肽，通过后续实验设计来测试在干扰了相对应的蛋白亚基情况下是否会对细菌生长存活产生影响。在最后的实验验证中发现有两种短肽具有显著的杀菌效果，分别简称BamA-h7（氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示）和BamD-h7（氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示）。

本发明中的两种多肽都是对耐药细菌具有较高抑制活性的多肽，而且两种多肽长度比较短，全长分别为9个氨基酸和25个氨基酸，大大的降低了合成的成本。两种多肽的全序列分别为：BamA-h7：缬氨酸-丙氨酸-甲硫氨酸-色氨酸-精氨酸-酪氨酸-亮氨酸-酪氨酸-丝氨（VAMWRYLYS）。BamD-h7：丙氨酸-苏氨酸-赖氨酸-精氨酸-亮氨酸-缬氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-精氨酸-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸-酪氨酸-谷氨酸-酪氨酸-丝氨酸-缬氨酸-丙氨酸-谷氨酸-酪氨酸-酪氨酸-苏氨酸-谷氨酸（ATKRLVFLKDRLAKYEYSVAEYYTE）。

体外抗菌实验结果表明，本发明的两种多肽在通过处理进入细胞内部后可以对革兰氏阴性细菌表现出良好的杀菌效果。杀菌曲线结果表明，BamA-h7在实验时间内能杀灭99.9%实验菌株，直到8小时候才有所恢复。而BamD-h7同样能在实验时间内杀灭大部分细菌，但恢复时间则为4小时。所述的实验菌株为革兰氏阴性细菌大肠杆菌。