[发明专利]一种香石竹叶片原生质体的制备方法

说明书

本发明属于植物组织和细胞培养技术领域，具体涉及一种香石竹叶片原生质体的制备方法。以香石竹组培苗为试验材料，建立了低速振荡酶解—沉降法纯化的高效的原生质体制备体系。本发明操作简便且可常年进行，经低速震荡酶解分离与密度梯度纯化后的原生质体产量高，可达183×10⁵个/gFW，细胞完整率高，并保证活力在75％以上。本发明为利用香石竹叶片瞬时转化体系进行基因功能鉴定、亚细胞定位以及蛋白质互作等方面的研究奠定了基础。

技术领域

本发明属于植物组织和细胞培养技术领域，具体涉及一种香石竹叶片原生质体的制备方 法。

背景技术

香石竹(Dianthus caryophyllus)，为石竹科石竹属植物，又名康乃馨，世界“四大切花” 之一，具有极高的观赏及经济价值。常规育种工作中，香石竹由于高度重瓣性，通常不结实， 这为香石竹杂交育种带来了极大困难。植物原生质体由于失去了细胞壁的包被，更易接受外 源DNA等物质，结合原生质体瞬时表达体系或者原生质体再生技术可为植物育种工作提供新 的技术路线，另外原生质体融合技术对于培育新品种同样有着重要意义。目前多种植物已成 功利用原生质体进行基因功能鉴定、亚细胞定位、蛋白质互作等方面的研究，而关于香石竹 原生质体制备的研究报道较少。邹吉涛等以叶片诱导愈伤组织，之后用愈伤组织上层体积小 而致密的表皮细胞为材料制备原生质体。Mii等对部分石竹属植物叶片进行了原生质体分离 及培养的相关研究，其中香石竹原生质体的产量最高也只达到54.3×10⁵个/gFM，李先源以香 石竹幼茎为材料，利用纤维素酶和离析酶进行震荡酶解10-12h，最终产量为8-9×10⁴个/g。 虽前人对香石竹原生质体培养体系已有报道，但其产量普遍较低，原有香石竹原生质体培养 体系急需提高和改善，在增加原生质体产量的同时提高原生质体的活性，将为后续利用原生 质体进行基因功能鉴定、亚细胞定位、蛋白质互作等方面的研究打下坚实的基础。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种香石竹叶片原生质体的制备方法，本发明的方法 可获得大量活性高的原生质体，进而为后续利用原生质体进行基因功能鉴定、亚细胞定位、 蛋白质互作等方面的研究打下坚实的基础。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种香石竹叶片原生质体的制备方法，包括以下步骤：

(1)在天气晴朗、干燥的上午采集田间生长的香石竹植株的嫩芽，适当剪去叶片，先用 洗衣粉水清洗，再用自来水在流水状态下冲洗；

(2)在超净工作台上将步骤(1)处理的香石竹嫩芽，用2％的次氯酸钠溶液浸泡30min， 浸泡期间适当摇晃，然用无菌水清洗；再用浓度为75％的乙醇浸泡30s，最后用无菌水冲洗 2-3次；取出消过毒的嫩芽用无菌滤纸吸干；

(3)将步骤(2)所得的香石竹嫩芽用解剖刀切去嫩芽下端2mm的茎段，将剩余部分作 为外植体接种至初代培养基上，培养温度为25±1℃，相对湿度为50％-60％，光照强度为 2000-3000lux，光照/黑暗周期为16h/8h，培养30d，得到初代组培苗；

(4)用解剖刀切取初代组培苗上新长出的幼苗，将幼苗转移至继代培养基上进行继代培 养，培养温度为25±1℃，相对湿度为50％-60％，光照强度为2000-3000lux，光照/黑暗周期 为16h/8h，继代培养30d；

(5)取上步生长健康的中部叶片，弃去下部老化叶片及顶芽嫩叶，将叶片置于垫有用FM 预处理培养基湿润的滤纸的培养皿中，在室温黑暗条件下处理48h；

(6)将上步所得叶片置于干净的滤纸上吸干残余溶液，转移至垫有用CM预处理培养基 湿润的滤纸的培养皿中，在4℃黑暗条件下处理24h；

(7)将上步所得叶片逐一用解剖刀切成0.5-1mm的条状，放入装有酶解液的锥形瓶中， 使酶解液充分浸没叶片，得到酶解混合物；