[发明专利]包含特别是减毒活重组黄病毒的稳定的疫苗组合物及其制备方法

说明书

一种稳定的冻干免疫原性组合物，其尤其包含减毒活重组黄病毒，更优选地减毒活重组登革热病毒、至少一个碳水化合物、和至少一个氨基酸，并且其特别适于快速冷冻干燥处理，其中，该组合物保留了病毒的期望特性，期望特性包括病毒生存力、免疫原性和稳定性。所述免疫原性组合物不含防腐剂、聚合物和表面活性剂。一种用于制造所述稳定的冻干免疫原性组合物的方法。

技术领域

本公开涉及生物技术领域，更具体地涉及减毒活黄病毒疫苗组合物及其制备方法。本公开还涉及减毒活黄病毒疫苗生产领域中的改进方法。

背景技术

黄病毒基因组由11个千碱基的单链正向RNA分子组成，其包含单个开放阅读框。RNA被转化成多蛋白，该多蛋白被加工成至少10种基因产物：3种结构蛋白——核衣壳或核心(C)、前膜(prM)和包膜(E)——和7种非结构(NS)蛋白——NS 1、NS 2A、NS 2B、NS 3、NS4A、NS 4B和NS 5。(Lindenbach BD等人，在由Knipe DM、Howley PM、Griffin PE等人编辑的《病毒学》中，费城：Wolters Kluwer，Lippencott Williams和Wilkins；2007年，第1101页-1152页)。许多这些黄病毒使用节肢动物(例如，叮咬蜱和/或蚊子)作为向病毒受体传播的手段。这种节肢动物传播的病毒(即，虫媒病毒)由于其在人类中的高致病性性质而构成了世界范围内主要的健康问题。(Fernandez-Garcia MD等人，Cell Host Microbe，2009年，5：第318页-328页)。更具体地，人类虫媒病毒病原体包括黄热病(YF)病毒、日本脑炎(JE)病毒、登革热(DEN)病毒、西尼罗河(WN)病毒和蜱传脑炎(TBE)病毒，这些病毒在自然界中存在于涉及蚊子或蜱载体以及鸟类和/或哺乳动物感受态储库宿主的生命周期中(Gubler D等人，在由Knipe DM、Howley PM、Griffin PE等人编辑的《病毒学》中，第5版，费城：WoltersKluwer、Lippencott Williams和Wilkins；2007年，第1153-1252页)。

然而，登革热病毒(DENV)已成为全世界最重要的人类虫媒病毒，其中，估计每年发生多达500百万例登革热感染，导致超过2百万例称为登革热出血热/登革热休克综合征的严重疾病并导致21000例死亡。有四种血清型登革热病毒，即，DENV1、DENV2、DENV3和DENV4。

已知有许多方法用于生产用于疫苗和其他目的的减毒活重组黄病毒制剂。用于冷冻、冻干或以其他方式储存活病毒制剂以供实验室或疫苗使用以便保持其活性的组合物和方法也是已知的。

黄病毒的水性组合物在高于5℃的温度下不允许长期具有良好的病毒稳定性。作为示例，YF-DEN(黄热病-登革热)嵌合体的大部分水性组合物在37℃下储存1天之后在液体中稳定后损失超过4个对数。现在，热稳定性是亚热带登革热流行国家中的严重问题，在亚热带登革热流行国家中，在冷链条件下运输是困难的。

冻干是稳定疫苗的常见方式。然而，冻干引起病毒效力的损失。疫苗随时间而失去效力，并且效力丧失的速率取决于温度。活病毒易受渗透冲击、热冲击和真空冲击的影响。包膜病毒具有脂双层，该脂双层因其高脆性而被认为是较不稳定的病毒组分。活病毒在冻干步骤例如冷冻、初步干燥、二次干燥中易受各种压力的影响，这些压力可能会影响病毒的理化稳定性。由于其结构，在冷冻干燥期间效力的损失可能是由于蛋白质去稳定(例如，解折叠、降解和聚集)、核酸降解、脂质层改变(例如，相变、机械损伤)、和与内部病毒环境(冰的形成)和外部病毒环境(pH和渗透压变化)的变化相关的压力引起的。冻干的脱水步骤导致蛋白质的氢键结构瓦解，这伴随着病毒表位的氨基酸组分的迁移率增加。据报道，在一些情况下，冻干导致病毒效力损失高达40％。

尽管可获得许多有关冻干期间药物肽、蛋白质和DNA的应激机制和稳定策略的信息，但由于病毒的分子复杂性、不同的去稳定途径、和缺乏允许在冻干期间和之后对抗原结构的物理-化学变化进行测量的分析技术，意味着病毒构成了特定的冻干挑战。冻干期间减毒活病毒疫苗的去稳定机制和保护机制还不是众所周知的。