[发明专利]疾病检测方法

说明书

本发明为使用LC‑MS对于生物试样所包含的作为生物标志物的肽的量进行测定、并基于该结果检测特定疾病的方法；在使用LC‑MS的测定之前所进行的前处理工序具备如下工序：向生物试样中添加用稳定同位素对所述肽进行标记而得到的稳定同位素试剂和三氟乙酸，从而制备混合试样液的工序；将混合试样液煮沸的工序；将经煮沸的混合试样液注入固相提取柱中，并且使该固相提取柱保持所述肽的工序；向固相提取柱中流入水溶性有机溶剂，将该固相提取柱所保持的肽洗脱的工序。

技术领域

本发明涉及基于血液、尿等生物试样所包含的特定成分的量的测定值检测特定疾病的方法，特别是涉及认知功能障碍疾病的检测方法。

背景技术

存在于从罹患了特定疾病的人采集到的血液、尿等生物试样中并且在从除此以外的人采集的生物试样中完全不存在、或者几乎不存在的物质，可以成为表示罹患了该疾病的生物标志物。因此，对于成为生物试样所包含的生物标志物的物质的量进行测定，由该结果进行诊断各种疾病。一直以来，在生物试样中的生物标志物的测定中，一直使用体外诊断试剂。

作为使用体外诊断试剂的生物标志物的测定方法之一，有将生物试样直接地、或者预先进行稀释，对于其中所包含的特定的蛋白质或肽利用抗原抗体反应进行测定的方法。例如，酶联免疫吸附测定法(ELISA)和化学发光免疫测定法(CLIA)使试样中的特定蛋白质或肽、与利用和底物反应时显色的酶进行了标记的第一抗体或第二抗体结合，以与蛋白质或肽结合了的抗体的显色量测定该蛋白质或肽量。另外，放射性免疫测定法(RIA)中，将第一抗体或第二抗体用放射性同位素进行标记，用与特定蛋白质或肽结合了的抗体的辐射线量测定该特定蛋白质或肽的量。进一步，特定的蛋白质等为酶的情况下，使用使该蛋白质与底物反应、并对由此产生的产物的量进行测定的酶活性测定法。

近年来明确的是，生物体处于正常状态时，在该生物体内以完全的状态存在的蛋白质(以下称为“完整蛋白质”)，在处于罹患特定疾病状态(疾病状态)的生物体中被消化分解而生成作为各种消化分解产物肽(或者消化分解产物蛋白质)的部分肽(或者部分蛋白质)；或者，由于蛋白质的翻译合成中的剪切异常等而以部分蛋白质或部分肽的形式被翻译合成。另外，明确的是，在疾病状态中，随着该疾病的加剧而被消化分解或翻译合成的部分蛋白质、部分肽的种类、量变化。因此，不仅诊断生物试样中完整蛋白质的量，也在摸索由该完整蛋白质与其部分蛋白质、部分肽的量、种类诊断疾病、其进行程度的方法。然而，利用了上述抗原抗体反应、酶与底物的反应的现有的测定方法均是单独测定蛋白质、肽的方法，因此，对于完整的蛋白质、其部分蛋白质、部分肽分别进行测定需要时间、花费功夫。另外，测定对象变多时，相应地需要从被检者(罹患疾病的人)采集很多生物试样。

对此提出了如下方法：使用液相色谱-质谱装置，网罗地测定生物试样中的多种蛋白质及其部分蛋白质、部分肽的量，基于该蛋白质、部分蛋白质、部分肽的存在图案、谱图来诊断疾病。例如，专利文献1中记载了如下方法：对于健康人与非酒精性脂肪性肝疾病患者或者脂肪肝与非酒精性脂肪性肝炎患者，由使用质谱装置对于是否存在、存在量不同的蛋白质及其部分肽进行了测定的结果，检测包含非酒精性脂肪性肝炎的非酒精性肝疾病。另外，专利文献2、3中记载了如下方法：对于健康人和肝癌患者，由使用质谱装置对于是否存在、存在量不同的蛋白质及其部分肽进行了测定的结果，检测肝癌。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2010-071900号公报

专利文献2：日本特开2006-308533号公报

专利文献3：日本特开2006-284389号公报

发明内容

发明要解决的问题