[发明专利]有效靶向敲入或基因置换的材料和方法

权利要求书

1.一种核酸构建物，按照5’到3’的顺序包含：

第一向导RNA(gRNA)靶序列，

与选定靶序列5’的序列同源的5’同源序列，

要插入所选靶序列的供体序列，和

与选定靶序列3’的序列同源的3’同源序列。

2.如权利要求1所述的核酸构建物，其中构建物还包含第二gRNA靶序列，其中第二gRNA靶序列在3’同源序列的3’端。

3.如权利要求1或权利要求2所述的核酸构建物，其中第一和第二gRNA靶序列是同一gRNA的靶标。

4.如权利要求3所述的核酸构建物，其中第一和第二gRNA靶序列包含SEQ ID NO:45中所示核苷酸序列。

5.如权利要求1-4任一所述的核酸构建物，其中5’同源序列长度为12bp-192bp，其中5’同源序列的长度可被3或4整除。

6.如权利要求1-5任一所述的核酸构建物，其中3’同源序列长度为12bp-192bp，其中3’同源序列的长度可被3或4整除。

7.如权利要求1-6任一所述的核酸构建物，其中5’同源序列长度为24bp。

8.如权利要求1-7任一所述的核酸构建物，其中3’同源序列长度为24bp。

9.如权利要求1-6和8任一所述的核酸构建物，其中5’同源序列长度为48bp。

10.如权利要求1-7和9任一所述的核酸构建物，其中3’同源序列长度为48bp。

11.如权利要求1-10任一所述的核酸构建物，其中构建物还在5’同源序列和供体序列之间包含编码肽的序列，所述肽导致翻译跳跃。

12.如权利要求11所述的核酸构建物，其中导致翻译跳跃的肽是2A。

13.如权利要求1-12任一所述的核酸构建物，其中要插入的供体序列编码报告物。

14.如权利要求13所述的核酸构建物，其中报告物是eGFP、TagRFP或Gal4VP16。

15.如权利要求13或14所述的核酸构建物，其中编码报告物的序列还编码核定位信号或膜定位CAAX序列。

16.如权利要求1-15任一所述的核酸构建物，其中构建物还在供体序列和3’同源序列之间包含聚腺苷酸序列(pA)。

17.如权利要求16所述的核酸构建物，其中pA是斑马鱼β肌动蛋白pA或SV40pA。

18.如权利要求1-17任一所述的核酸构建物，其中供体序列长度为约1bp-约12,000bp。

19.如权利要求1-18任一所述的核酸构建物，其中供体序列长度为约100bp-约1000bp。