[发明专利]丙酮酸羧化酶和编码丙酮酸羧化酶的DNA、包含该DNA的质粒以及用于生产的微生物和用于制备其生物合成包含草酰乙酸作为前体的产物的方法以及染色体

说明书

本发明涉及丙酮酸羧化酶和编码丙酮酸羧化酶的DNA、包含该DNA的质粒以及用于生产的微生物和用于制备其生物合成包含草酰乙酸作为前体的产物的方法以及染色体。根据本发明提供了编码丙酮酸羧化酶并具有与序列编号1至少70％同一性的DNA，其中在位置1027‑1029中的编码苏氨酸‑343的三联体被替换成编码丙氨酸的三联体。在一个优选的实施方案中，在该DNA中另外在位置3034‑3036中将编码异亮氨酸的三联体替换成编码丝氨酸的三联体。通过所述基因的表达，获得丙酮酸羧化酶，通过该丙酮酸羧化酶可以将其生物合成包含草酰乙酸作为前体的产物的产率相对于具有天然Pyc的菌株而言增加9至19％。

本发明涉及丙酮酸羧化酶和编码丙酮酸羧化酶的DNA、包含该DNA的质粒以及用于生产的微生物和用于制备其生物合成包含草酰乙酸作为前体的产物的方法以及染色体。

谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）在工业上用于制备氨基酸，特别是L-谷氨酸和L-赖氨酸。为了生产L-赖氨酸，从柠檬酸循环中取出中间体草酰乙酸，因为其用作天冬氨酸家族的氨基酸或氨基酸盐的前体。所述天冬氨酸家族的氨基酸或氨基酸盐是L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苏氨酸和L-异亮氨酸。为了能够使柠檬酸循环在虽然取出这些中间体的情况下仍进一步进行，其必须通过所谓的添补反应来重新补充。当在糖上生长时，草酰乙酸池通过丙酮酸或磷酸烯醇丙酮酸羧化成草酰乙酸来补充。通过酶，即丙酮酸羧化酶（Pyc）催化由丙酮酸和二氧化碳或HCO₃-以ATP依赖性的形式形成草酰乙酸。因此，对于天冬氨酸家族的氨基酸例如L-赖氨酸和谷氨酸家族的氨基酸例如L-谷氨酸的工业微生物生产而言，Pyc的高活性是重要的。此外，对于衍生自柠檬酸循环中间体的其它代谢物的生产，高Pyc活性是有益的。

谷氨酸棒状杆菌的天然Pyc的酶活性以变构的方式尤其被天冬氨酸抑制，因此在高细胞内天冬氨酸浓度下仅具有有限的活性。因此，L-赖氨酸和衍生自草酰乙酸的其它产物的生产也受到限制，因为仅提供有限量的前体代谢物。迄今所述的Pyc变异体仅导致L-赖氨酸生产的适度增加。

Peters-Wendisch等人在Journal of Molecular Microbiology andBiotechnology (2001) 32: 295-300 中的公开文献“Pyruvate carboxylase is a majorbottleneck for glutamate and lysine production by Corynebacterium glutamicum”公开了菌株谷氨酸棒状杆菌 DG52-5中pyc基因的缺失导致赖氨酸效价（Titer）减少60％，而菌株DG 52-5中 pyc基因的由质粒介导的过表达导致赖氨酸效价增加50％。此外显示，在野生型菌株ATCC13032中pyc基因的缺失将由吐温60诱发的 L-谷氨酸生产减少约50％，而pyc基因的基于质粒的过表达将谷氨酸形成增加700％。高Pyc活性对于生产赖氨酸和谷氨酸的重要性稍后也还在其它出版物中显示（Blombach等人 2007 Applied Microbiologyand Biotechnology 76: 615-623；Shirai等人 2007 Microbial Cell Factories 6: 19；Neuner和Heinzle 2011 Biotechnology Journal 6: 318-329；Neuner等人 2013 Journalof Biotechnology 163: 217-224；Guo等人 2013 Biotechnology Letters 35: 943-950）。