[发明专利]用于单细胞的大量平行组合分析的系统和方法

说明书

本文提供了使得能够在与其他类型的单细胞孵育的背景下平行评估个体细胞或细胞亚群中的多种功能性核酸的方法。关键的见解是同时测量衍生自至少两种不同细胞类型的小群体的多核酸，使得一种细胞类型的功能与另一细胞的克隆身份相关联。这些方法同时处理数千、数百万或更多单细胞或小细胞群。所述方法集成了分子、算法和工程方法。本发明在许多生物学和医学领域中具有广泛和有用的应用，包括免疫学和药物发现。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年3月13日提交的美国临时申请号62/470,836的权益，该临时申请的全部内容通过引用并入本文。

序列表

本申请包含已经通过EFS-Web提交的序列表，并且其全部内容通过引用并入本文。在2018年3月13日创建的所述ASCII拷贝命名为39523WO_CRF_SequenceListing，大小为35,480字节。

背景技术

生物细胞是极其多样的和产生极其多样化的生物学功能。因此，细胞的功能性分析几乎是任何生物学实验的基本要求。因为甚至遗传上同质的单细胞群具有异质的生物学功能，所以生物学实验最好在单细胞水平上进行。然而，使用常规方法难以或不可能进行单细胞功能性分析。

传统地，在响应于暴露于“诱导细胞”，“靶细胞”的功能性分析在组织培养板中进行，例如，6孔或96孔板上。将感兴趣的靶细胞与诱导细胞类型一起孵育，然后通过评估蛋白质、转录物或其他种类的生物标志物来测量靶细胞的应答。这样的方法总是在大量群体上进行，即数百、数千或数百万个靶细胞与数百、数千或数百万个诱导细胞一起孵育，以确定靶细胞对诱导细胞的响应。然而，靶细胞群和诱导细胞群在遗传和表型上具有固有的多样性。即使具有难以区分的基因组序列的细胞也可能对诱导细胞产生不同的反应，因为表观遗传差异、环境差异或科学目前未知的原因。

此外，尚未获得对单个靶细胞或诱导细胞进行功能测定足够灵敏的方法。通常，诱导细胞和非诱导细胞之间的转录物计数的定量差异仅为2倍、5倍或10倍，因此需要高度灵敏的方法。类似地，尚未获得足够高通量以平行测定数百万个单靶细胞或诱导细胞的方法。另外，功能性分析通常需要同时测量靶细胞和诱导细胞两者中的转录物，例如，通过同时测量和测序两种细胞类型中的转录物。如果没有这样的灵敏、高通量和组合筛选方法，就很难理解暴露于诱导细胞的单个靶细胞的功能响应，更不用说平行的数百万个单靶细胞或诱导细胞。

发明内容

本发明涉及一种与用于检测靶细胞对诱导细胞的响应的方法相结合的可以分离单靶细胞与单诱导细胞或诱导细胞群的高通量技术(图1)。在一些实施方式中，靶细胞和诱导细胞另外与“中间”细胞一起孵育，所述“中间”细胞是一种诱导细胞。本发明提供了一种用于检测诱导和非诱导细胞之间仅为2倍、5倍或10倍的转录物计数定量差异的高灵敏度的方法。本发明还能够进行组合测量，使得可以以数百万种可能的成对组合分析不同的靶细胞群和诱导细胞群。本发明的一些方法涉及通过系链(tether)或连接来自一种以上细胞类型的多核酸而产生的多核酸的定量。所述方法提供了在孔板方法中不可能的单细胞功能筛选的新方法。所述方法进一步提供了追踪功能性读取结果至单靶细胞、中间细胞或诱导细胞中的遗传差异的能力。

本发明的一个方面涉及一种用于生物细胞的功能性分析的方法，其包括：(1)将来自第一细胞类型的多个靶细胞克隆的单个靶细胞和来自第二细胞类型的多个诱导细胞克隆的一个或多个诱导细胞分离成单分散乳液微滴；(2)在所述单分散乳液微滴中孵育分离细胞，其中所述分离细胞包含所述单个靶细胞和所述一个或多个诱导细胞；(3)将含有裂解试剂的水溶液引入到所述单分散乳液微滴中，从而诱导所述分离细胞的裂解；(4)捕获从固体表面上的所述分离细胞释放的RNA；和(5)产生包含来自所述分离细胞的转录物的杂交多核酸的文库，其中所述杂交多核酸指示在孵育所述分离细胞的步骤后所述单个靶细胞的转录变化。