[发明专利]多焦结构化照明显微系统和方法

说明书

公开了用于生成样本的多焦图案的多焦选择性照明显微(SIM)系统的各种实施例(300、400、500)。多焦SIM系统的实施例(300、400、500)对完整地扫描该样本的多焦图案序列中的每个生成的多焦图案进行聚焦、缩放与求和操作，以产生高分辨率合成图像。

技术领域

本文档涉及多焦结构化照明显微(multi-focal structured illuminationmicroscopy)，并且具体涉及用于产生由样本的多焦图案(pattern)引起的多个多焦荧光发射的多焦结构化照明显微系统和方法。

背景技术

经典的荧光显微在分辨率方面受到光的波长限制，被称为“衍射极限”，当样本发射由显微镜(microscope)检测的荧光时，在典型的激发和发射波长下，衍射极限将横向分辨率限制为约200nm，并且将轴向分辨率限制为约500nm。共焦(confocal)显微是一种光学成像技术，其用于通过使用点照明和空间针孔布置来消除来自比焦平面厚的试样的离焦(out-of-focus)发射光，以将光学分辨率增加超出衍射极限，从而通过需要紧密关闭针孔的方法来传送分辨率是衍射极限的1.41倍的图像。不幸的是，关闭针孔会使从样本发射的光的信号水平降低到一定程度，使得这种特定的超分辨率方法不实用。另外，共焦显微镜必须将来自显微镜的照明光束的激发与针孔/探测器完美对准，因为未对准的针孔会导致正检测到的光信号减少和变弱，并且导致样本本身的轴向光学切片(section)减少。因此，共焦显微镜的未对准可能引起光信号的减少。

已经发现一种用于共焦显微的分辨率增强的方法，其使用检测器阵列，诸如相机图像中的像素，其中阵列中的每个检测器产生单独的共焦图像。如果探测器阵列足够小，则每个形成的共焦图像可以等价于由具有紧密闭合的针孔的共焦显微镜形成的相似共焦图像，使得当共焦图像被恰当对准时，实现受衍射限制的显微镜的1.41倍的分辨率。此外，反卷积提供了图像分辨率的进一步增加。然而，该探测器阵列布置是受限制的，因为在样本的整个二维平面中仅扫描单个激发点，这限制了样本可以被扫描的速度以及对样本的荧光发射的后续检测。

另一种类型的显微，称为结构化照明显微(SIM)，其使用空间调制的激发强度来照明样本，该空间调制的激发强度被平移和旋转到相对于样本的不同位置，在每次平移和旋转时拍摄宽视野(wide-field)图像。适当地处理原始图像得到最终图像，最终图像具有的横向分辨率是传统宽视野显微的横向分辨率的两倍。虽然这样的SIM系统生成的图像的空间分辨率是传统显微镜的2倍，但是当产生最终图像时却牺牲了时间分辨率，因为需要时间来获取多个原始图像中的每个。SIM还可以用于滤除离焦模糊(blur)，称为“光学切片”。然而，这样的光学切片是以计算的方式进行的，并且因此经受散粒(泊松)噪声。因此，当背景荧光可能引起该散粒噪声贡献超过焦内(in-focus)信号时，SIM不适合于厚的或高度染色的样本。

因此，本领域需要一种结构化照明显微系统，其为了每个高分辨率图像产生样本的多焦激发图案，而不牺牲扫描速度，并且对可能干扰SIM图像的散粒噪声有抵抗力。

发明内容

在一个实施例中，显微系统可以包含用于传输单个光束的光源和用于将单个光束分成多个光束以形成多焦图案的分束器。扫描器将形成多焦图案的多个光束扫描到样本上，使得样本生成由每个多焦图案产生的多个荧光发射。聚焦部件然后限定孔径(aperture)，孔径被配置为物理地阻挡由每个多焦图案产生的多个荧光发射的离焦荧光发射，并且允许焦内荧光发射穿过孔径。另外，缩放部件按比例缩小由每个多焦图案产生的多个焦内荧光发射，使得多个焦内荧光发射中的每个按比例缩小预定因子，以产生由每个多焦图案产生的多个缩放的焦内荧光发射。求和部件对多个缩放的焦内荧光发射中的每个求和，以产生多个求和的、缩放的焦内荧光发射，其形成多个求和的、缩放的焦内荧光发射的合成图像。