[发明专利]一种高效内切木聚糖酶生产菌的筛选方法及其应用

说明书

本发明提供一种高效内切木聚糖酶生产菌的筛选方法及其应用，包括：(1)样品来源；(2)菌株筛选；(3)木聚糖酶发酵液的制备等步骤，本发明首先在生长培养基进行菌株的分离培养，再利用双层平板法进行菌株的筛选，上层培养基中添加Azo‑xylan(Birchwood)作为筛选底物，该方法可以解决先培养微生物，再加入刚果红溶液进行颜色反应过程中菌落之间发生混杂的问题，还可以解决在制备平板时加入刚果红，再进行微生物培养过程中出现的假阳性问题。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种效内切木聚糖酶生产菌的筛选方法及其应用。

背景技术

半纤维素是存在于自然界中非常丰富的资源，约占植物干重的35％，广泛存在于农副产品如玉米芯、麦麸、米糠、秸秆及甘蔗渣中，在自然界中含量仅次于纤维素。木聚糖是半纤维素的重要组成部分，是由β-D-吡喃型木糖单元经β-1,4-糖苷键连接构成主链，主链上带有乙酰基、阿拉伯糖残基和葡萄糖残基等多种不同的取代基，来源或分支程度不同的主侧链与不同的取代基共同构成的复杂而多样的木聚糖分子。木聚糖的完全降解需要多种酶的共同参与，包括β-1,4-内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)、β-木糖苷酶、(EC3.3.1.37)和阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)等，其中，β-1,4-内切木聚糖酶是作用于木聚糖主链生成不同链长的寡糖，是木聚糖降解酶系中最关键的酶，同时也是目前研究较多，应用较广泛的木聚糖降解酶。利用酶法生产的低聚木糖在动物肠道内对双歧杆菌等有高选择性增殖效果，在降低当胆固醇、维持肠道健康和促进钙吸收等方面都有重要的作用。另外，木聚糖酶在制浆造纸、食品、饲料添加剂及生物转化等方面都起到重要的作用。

目前木聚糖降解菌株的筛选多用刚果红染色法，主要通过两种方式，一种方式是先培养微生物，再加入刚果红溶液进行颜色反应，然后通过氯化钠脱色形成大小不一的木聚糖降解透明圈，这种方式的优点是显示出的颜色反应基本上是木聚糖降解菌的作用，缺点是该方式操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；另一种方式是在制备平板时加入刚果红，该方式的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质,能使产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应，另外某些具有降解色素能力的微生物在长时间的培养过程中会降解刚果红而形成透明圈，不易与木聚糖降解菌区分。本发明首先在生长培养基进行菌株的分离培养，再利用双层平板法进行菌株的筛选，上层培养基中添加Azo-xylan(Birchwood)作为筛选底物，可以解决上述问题，能快速、准确、有效的筛选内切木聚糖酶生产菌株。另外，利用该方法筛选到的菌株Saccharothrixvariisporea YJ与以往报道筛选的菌株不同，其所产木聚糖酶可以直接水解玉米芯粉生产低聚木糖，省去了碱处理玉米芯制备木聚糖的步骤，从而降低了环境污染以及生产成本。

发明内容

对于以上现有技术中出现的问题，本发明以Azo-xylan(Birchwood)为筛选底物，利用双层平板法，可以解决上述问题。Azo-xylan(Bichwood)是由来源于桦木的木聚糖与染料Remazol brilliant blue R结合生成的高分子化合物(1个Remazol brilliant blue R结合20个糖残基)；木聚糖酶可以降解Azo-xylan生成低分子量的染料化合物和低聚糖，低分子量的染料化合物在乙醇溶液中是可溶性的(在上层平板的培养基中呈现透明状态)，而高分子量的染料化合物在乙醇溶液中则呈现为沉淀状态(在上层平板的培养基中呈现蓝色状态)。本发明在上层平板中添加Azo-xylan作为筛选底物，生产木聚糖酶的菌株在上层平板中产生透明圈，该方法能快速、准确、有效的筛选内切木聚糖酶生产菌株。本发明是通过以下技术方案实现的：一种高效内切木聚糖酶生产菌的筛选方法及其应用，包括以下步骤：

(1)样品来源：堆置发酵时间为3d，发酵温度为40℃的猪粪与甘蔗叶混合堆肥20g，初始C/N比为25:1，含水率为60％，初始pH为8.0得到发酵物；