[发明专利]一种新鲜烟叶中内源水溶性B族维生素的检测方法

说明书

本申请属于烟草代谢组学中的烟草内容物检测技术领域，具体涉及一种新鲜烟叶中内源水溶性B族维生素的检测方法。该检测方法针对新鲜烟叶中内源水溶性B族维生素进行检测，具体用于分别或者同时对9种B族维生素中一种或任意几种进行定性或者定量检测。本申请采用液质联用分析新鲜烟叶样品中相关维生素B族成分含量时，具有：前样品处理简单，定量定性时分辨率高、灵敏度高、快速简便、干扰小、适用于复杂基质样品等优点，尤其是可对较宽浓度范围全九种植物内源性B族维生素同时测定，而且测定时间较短，一个样本检测仅需18min，并且该检测方法灵敏度高、精密度好、加标回收率高，因此具有较好的实用价值和推广应用意义。

技术领域

本申请属于烟草代谢组学中的烟草内容物检测技术领域，具体涉及一种新鲜烟叶中内源水溶性B族维生素的检测方法。

背景技术

植物是自然界中维生素B族的主要制造者，但是植物体内维生素B族的研究开展较晚。烟草作为一种模式植物，其体内的维生素B族可以作为生长调节剂来刺激烟草的生长发育，其中维生素B族的含量、代谢特征都对烟草的生长有较大的影响；因此准确检测植物维生素B族在植物体内的含量变化，是了解其生理机制、代谢途径的重要前提。

现有技术中，测定植物维生素B族的方法主要有差分脉冲伏安法（DPV）、高效液相色谱法（HPLC）、薄层色谱分析法（TLC）以及液相色谱‒串联质谱法（LC‒MS/MS）等，但针对不同类型植物应用时，各种检测方法的适用性存在一定局限性。而就烟草而言，建立一种烟叶中高通量、高灵敏度和较为标准化的维生素B族检测方法，对研究植物维生素B族的代谢和烟叶培育具有重要意义。

发明内容

本申请目的在于提供一种可以检测新鲜烟叶中多种内源水溶性B族维生素（维生素B₁、维生素B₂、维生素B₃、维生素B₅、维生素B₆、维生素B₇和维生素B₉、维生素B₁₂和维生素B₁₆）的检测方法，从而为烟草代谢组学的深入发展奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种新鲜烟叶中内源水溶性B族维生素的检测方法，该检测方法针对新鲜烟叶中内源水溶性B族维生素进行检测，可以分别或者同时对维生素B₁、维生素B₂、维生素B₃、维生素B₅、维生素B₆、维生素B₇和维生素B₉、维生素B₁₂和维生素B₁₆中一种或任意几种进行定性或者定量检测，该方法具体包括如下步骤：

（一）对新鲜烟叶进行预处理

（1）首先，将新鲜烟叶利用液氮速冻，冷冻干燥后粉碎机打碎（粉碎100~300目），备用；

（2）其次，以0.5 mmol/L盐酸溶液作为提取液，每20mg粉碎烟叶样品中，加入提取液0.5~1.5mL（优选1mL），35~42℃进行萃取30~60min，需要注意的是，萃取操作时应当避光，优选操作为：40℃避光萃取40min（进一步优选操作为利用超声辅助萃取，具体例如采用美国sonics公司的超声波细胞破碎仪超声功率为60%条件下进行辅助超声萃取操作）；

（3）最后，将上述混合体系15000~20000转离心10~20min，（优选4℃、20000转离心10min），取上清液，利用0.45μm滤膜过滤，取滤液进行测定；

（二）利用HPLC-MS/MS（液相色谱-串联质谱联用）绘制标准曲线