[发明专利]一种线粒体膜电位荧光探针及其合成方法和应用

说明书

本发明提供了一种线粒体膜电位荧光探针及其合成方法和应用。探针的结构式为：。上述探针可以以6‑羟基‑2‑萘甲醛和碘己烷的反应产物6‑己氧基‑2‑萘甲醛与2‑甲基喹啉和碘甲烷的反应产物1,2‑二甲基‑喹啉碘盐合成。本发明的探针能够用于分别不同的膜电位。本发明提供的荧光探针本发明的探针对线粒体膜电位响应时荧光波长位移大、对细胞毒性低；其合成方法简单、纯化步骤简便。该探针成功应用于细胞成像，可以分辨线粒体膜电位的变化。

技术领域

本发明属于有机小分子荧光探针领域，具体涉及一种检测线粒体膜电位的荧光探针及其合成方法。

背景技术

线粒体三羧酸循环过程中，会将线粒体内部的质子主动运输到线粒体外，从而形成了达-160mV ~ -180mV的内负外正的线粒体膜电位。线粒体膜电位为有氧呼吸过程提供能量，催化其分解具有高稳定性的化合物。此外，线粒体膜电位与细胞状态息息相关，线粒体膜电位的水平可以精确反映细胞的健康状态。因此，实时观测线粒体膜电位的变化具有重要的生理学、病理学和药理学意义。

到目前为止，荧光成像是研究线粒体膜电位变化的最重要工具。线粒体体积微小，难以精准的嵌入电极，这限制了电化学方法在检测线粒体膜电位上的应用。相比之下，荧光成像法具有对生物样本低损伤、可进行原位、动态观测等优点，是用于研究线粒体膜电位的理想工具。目前，TMRM和JC-1是常用于研究线粒体膜电位的荧光探针。TMRM常用于计算线粒体膜电位的大小，然而计算过程繁琐，限制了其在生物研究中的应用。JC-1在高膜电位的线粒体中呈现J-聚集态，发射橘红色荧光；在低膜电位的线粒体中呈现单体态，发射黄色荧光；因此JC-1可以通过荧光颜色的变化反映线粒体膜电位的状态，是常用于生物研究的线粒体膜电位探针。然而该探针对膜电位响应的荧光波长位移仅70 nm，这限制了其在细胞成像中的应用。近年来，人们在JC-1结构的基础上改造了数例线粒体膜电位探针，然而由于母体限制，荧光波长位移并无太大改变。因此，发展一种具有大荧光光谱位移的线粒体膜电位探针至关重要。

发明内容

针对现有技术中线粒体膜电位探针种类单一，且荧光波长位移较小的问题，本发明提供一种线粒体膜电位探针，该探针选择性好、灵敏度高，具有大荧光光谱位移，发射波长位移在140nm左右。

本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针的合成方法，原料易得、合成步骤简单。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种线粒体膜电位探针，简称为HOQ，其结构式如式（I）所示：

式（I）。

一种上述探针的合成方法，包括以下步骤：

（1）6-羟基-2-萘甲醛和碘己烷在碳酸钾存在下于DMF中室温反应，然后将反应液分离纯化得6-己氧基-2-萘甲醛(1)；

（2）2-甲基喹啉和碘甲烷在乙醇中40-60℃反应，反应完毕后将反应体系冷却至室温，过滤并使用乙醇洗涤固体析出，得1,2-二甲基-喹啉碘盐(2)；

（3）6-己氧基-2-萘甲醛(1)与1,2-二甲基-喹啉碘盐(2)在吡咯烷存在下于乙醇中反应，室温反应后过滤得粗产物，以乙醇重结晶得2-(6-己氧基-2-萘乙烯基)-N-甲基-喹啉碘盐，即荧光探针HOQ。

步骤（1）中，所述6-羟基-2-萘甲醛与碘己烷的摩尔比为1:1-2。

步骤（1）中，所述分离纯化步骤为反应液加入过量水，然后用二氯甲烷萃取，有机层加无水硫酸镁干燥，然后蒸除二氯甲烷，最后以石油醚/乙酸乙酯=20:1v/v为流动相过硅胶色谱柱分离。

步骤（1）中，反应时间为12-36h。步骤（2）中，反应时间为24-48h。步骤（3）中，反应时间为12-24h。