[发明专利]一种高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶荧光探针

说明书

本发明提供了一种高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶荧光探针，该探针的结构式如(1)所示，其为可用于碳酸酐酶检测和荧光成像的4‑取代萘酰亚胺类染料，该染料具有合成原料低廉、方法简单且易于衍生等优点。研究表明，其上含有的苯磺胺结构可以高选择性地结合细胞内的碳酸酐酶；在萘酰亚胺染料4‑位引入氮杂环丁烷可以抑制TICT过程，增加染料的亮度和光稳定性。该染料在乙醇中的摩尔消光系数达15382M^‑1cm^‑1，量子产率达到0.52。染料在水环境中表现为短荧光寿命，在结合碳酸酐酶后处于弱极性环境中表现为长荧光寿命，荧光寿命由4.27ns增加至10.6ns。该碳酸酐酶染料有很高的亮度和光稳定性，能够快速标记碳酸酐酶并利用于碳酸酐酶检测、荧光成像及荧光寿命成像等领域。

技术领域

本发明属于荧光成像技术领域，具体涉及一种高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶荧光探针。

背景技术

荧光成像技术是一种灵敏度高、选择性好的光学显微成像技术，被广泛应用在生物技术、细胞成像、药物代谢等领域进行相关研究。近年来，新兴的超分辨荧光显微技术进一步将光学显微镜的分辨率提升至数十纳米甚至几个纳米。碳酸酐酶是一种含Zn²⁺的金属酶，研究表明其在生物体内承担着多种生理学功能，并与多种癌症的发生息息相关，利用荧光染料标记碳酸酐酶进而进行荧光成像，可以了解碳酸酐酶的数量、在细胞中的分布等信息，对疾病诊断、治疗有着重要的意义。

染料需要有足够的亮度才能使发出的荧光信号被检测到，此外还需要光稳定性才能在长时间的观测中不被漂白，现有的荧光染料大多难以满足这样苛刻的要求。例如萘酰亚胺类染料是典型的推-拉电子体系染料，染料在激发态时容易通过TICT(分子内扭转电荷转移)的方式损耗大量能量，大大降低了染料的亮度及光稳定性，极大地限制了它们的应用。此外，现有的对于碳酸酐酶的荧光分析与成像技术大多依赖于荧光强度的测量，然而荧光强度的测定容易受激发光强度、染料分布浓度、光漂白等因素的影响，其结果的准确性受到了很大的影响。荧光寿命成像技术的出现较好的解决了这个问题，荧光寿命是是荧光分子固有的特征参数，与绝对发光强度无关，因而测定时不受激发光强度、荧光团浓度等因素的影响。然而有机小分子荧光染料的寿命通常较短(约为10^-9秒)，结合目标分子前后的寿命变化较小。因此，如何通过简单的结构修饰，使染料既有高亮度、高光稳定性以满足高分辨荧光成像，又能在结合碳酸酐酶前后产生明显的寿命变化以实现高分辨的荧光寿命成像成为了一个巨大的挑战。

发明内容

本发明提供了一种高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶荧光探针，该探针为4-取代萘酰亚胺类荧光探针，其上含有的苯磺胺结构可以高选择性地结合碳酸酐酶。通过在染料4-位引入氮杂环丁基，有效地抑制了TICT过程，增加了染料的亮度和光稳定性。染料从细胞培养基到与碳酸酐酶结合前后微环境产生变化，荧光寿命有明显增加。该探针可以实现碳酸酐酶的标记检测，可以应用于碳酸酐酶的荧光显微成像及荧光寿命显微成像。

本发明一种高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶荧光探针，以4-取代萘酰亚胺染料为结构单元，其结构式如下所示：

一种高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶荧光探针的合成方法，合成步骤如下：

具体合成步骤如下：

步骤一：中间体N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-1,8-萘酰亚胺(SML-Br)的合成：

将4-溴-1,8-萘酐与4-(氨甲基)苯磺酰胺盐酸盐及三乙胺溶解于无水乙醇中，升温至60-80℃，搅拌8-15h后减压除蒸溶剂，通过硅胶柱色谱分离提纯，得到中间体N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-1,8-萘酰亚胺。

步骤二：探针N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-氮杂环丁基-1,8-萘酰亚胺(SML-Aze)的合成：