[发明专利]一种用于检测细胞早期凋亡的Annexin V荧光标记的方法

说明书

本发明提供了一种用于检测细胞早期凋亡的Annexin V荧光标记的方法，具体的标记方法如下：(1)构建pET‑22b‑SNAP‑Annexin V基因融合质粒载体；(2)通过原核表达并纯化pET‑22b‑SNAP‑Annexin V融合蛋白；(3)用荧光小分子标记融合蛋白并纯化。Annexin V蛋白是目前发现的最佳PS结合受体之一，表现为对PS结合的高选择性和高结合力，荧光标记的Annexin V是目前检测早期细胞凋亡的最常用试剂之一。本发明创造了Annexin V荧光标记的新方法，首先通过基因工程方法将SNAP标签蛋白与Annexin V蛋白融合、表达并纯化，随后用连接SNAP蛋白专一底物BG基团的小分子荧光探针标记融合蛋白进而标记Annexin V，通过细胞成像或者流式细胞仪检测凋亡细胞。本发明对细胞凋亡过程研究具有重要的意义。

技术领域

本发明属于生物分析检测领域，具体涉及一种用于检测细胞早期凋亡的AnnexinV荧光标记的方法。

背景技术

细胞凋亡是生物体维护内环境稳定而发生的程序性死亡。细胞凋亡异常会导致肿瘤、神经退行性和自身免疫性等多种疾病的发生。基于原位、实时和灵敏度高的特点，荧光检测细胞凋亡能够示踪凋亡过程，帮助解析凋亡异常相关疾病发生机理、筛选新药和建立有效的治疗方法。正常细胞中磷脂酰丝氨酸(PS)位于细胞质膜的内侧，而在细胞凋亡早期，PS从细胞质膜的内侧翻转到细胞质膜的外侧，是细胞凋亡开始的重要信号。因此，PS被用作检测细胞凋亡可靠标志物，通过识别细胞外膜的PS就可以检测凋亡细胞。Annexin V蛋白是目前发现的最佳PS结合受体之一，表现为对PS结合的高选择性和高结合力，而荧光标记的Annexin V就成为目前检测早期细胞凋亡的最常用试剂之一。

Annexin V主要通过共价连接小分子有机荧光染料或融合荧光蛋白的方式实现荧光标记。其中有机荧光染料通过与Annexin V蛋白上的侧链氨基发生偶联反应实现标记，但这种反应没有选择性，很难控制Annexin V上标记的位点和连接上的荧光染料分子数目。研究表明，多于两个荧光染料分子的标记会导致Annexin V失活。不影响Annexin V活性的荧光单分子标记工艺实现困难，因此商品化的高效荧光染料标记的Annexin V试剂价格昂贵。荧光蛋白采用遗传编码融合的方式，虽然解决了定点和定量标记的问题，但荧光蛋白光稳定性差、波长范围有限而使得应用受到限制，同时也存在尺寸太大而影响Annexin V活性的顾虑。

蛋白标签荧光标记法是目前常用的蛋白质定点标记的方法，作用过程是首先将标签蛋白与目标蛋白的融合表达，随后带有底物基团的荧光小分子通过与标签蛋白的专一性作用实现标记。SNAP标签蛋白是常用的蛋白标签，SNAP标签蛋白能够与O⁶修饰的苯甲基鸟嘌呤(常称作BG基团)通过亲和反应共价连接，因此连接有BG基团的荧光小分子能够专一、快速的与SNAP标签蛋白反应，进而标记目标蛋白。

发明内容

本发明开发了一种用于检测细胞早期凋亡的Annexin V荧光标记的方法。首先通过基因工程方法构建SNAP标签蛋白与Annexin V蛋白融合的质粒载体，然后原核表达并纯化，用连接SNAP蛋白专一底物BG基团的小分子荧光探针标记融合蛋白并且纯化，通过流式细胞仪检测凋亡细胞。本发明对细胞凋亡过程研究具有重要的意义。

本发明所述的一种用于检测细胞早期凋亡的Annexin V荧光标记的方法，具体的标记方法如下：

(1)构建PET-22b-SNAP-Annexin V基因融合质粒载体

(2)通过原核表达并纯化PET-22b-SNAP-Annexin V融合蛋白

(3)用荧光小分子标记融合蛋白并纯化

一种用于检测细胞早期凋亡的Annexin V荧光标记的方法，pET-22b-SNAP-Annexin V融合基因质粒载体构建方法如下：