[发明专利]一种基于SNAP-tag技术的自闪烁超分辨荧光染料及其合成和应用

说明书

本发明提供了一种基于SNAP‑tag技术的自闪烁超分辨荧光染料及其合成和应用，该荧光染料的结构(1)所示，通过引入氮杂环丁烷抑制硅罗丹明的分子内旋转，从而具有高光稳定性、高量子产率等特点。而且由于染料分子内螺化的热力学平衡，该荧光染料可以不断闪烁，进而应用于超分辨荧光成像。此外，该探针能够在活细胞内对融合有SNAP‑tag标签的多种目标蛋白进行特异性标记，实现活细胞内目标蛋白的示踪。本项目发明的SNAP‑tag自闪烁超分辨荧光染料在蛋白标记、蛋白与蛋白的相互作用，以及超分辨荧光成像等领域具有广泛应用。

技术领域

本发明属荧光染料技术领域，具体涉及一种基于SNAP-tag技术的自闪烁超分辨荧光染料及其合成和应用。

背景技术

蛋白标签技术结合了蛋白的遗传编码特性以及小分子的优良光物理特性，其在研究蛋白的功能、蛋白与蛋白的相互作用中具有广泛的应用。荧光显微成像技术作为原位、无损追踪这类动态生命活动的主要工具，其分辨率长期无法突破衍射极限的限制。而近些年来超分辨成像技术将荧光显微成像的分辨率提升至20nm，为蛋白的相关研究带来了新的机遇。研究工作者可以从更精细的结构中提取蛋白与蛋白相互作用、蛋白分布等信息。

当前，单分子定位显微镜在对荧光标记的生物分子进行超分辨率图像构建时，通常需要进行强激光照射以及添加硫醇等添加剂来诱导荧光团的开关。但是，强激光照射会导致严重的细胞损伤，加入的硫醇也会对细胞结构产生很大的影响，这些条件限制了超分辨技术潜在应用。自闪烁荧光染料由于分子内螺环的热力学平衡，其在基态没有颜色和荧光，即可通过分子内开关不断闪烁。因此，在近生理条件下，能够在不需要大功率激光照射或任何添加剂下即可自发闪烁的荧光团对于活细胞超分辨成像是极其重要的。

发明内容

本发明提供一种基于SNAP-tag技术的自闪烁超分辨荧光染料及其合成和应用，一种高亮度的SNAP-tag的自闪烁荧光染料，该染料能够特异性识别SNAP-tag蛋白并进行超分辨成像。

一种高亮度的用SNAP-tag的自闪烁荧光染料，该荧光染料具有如下结构：

本发明提供一种高亮度的用SNAP-tag的自闪烁荧光染料，该染料具有高光稳定性、高量子产率，荧光量子产率达到0.8(在水中)。

发明提供一种高亮度的用于SNAP-tag蛋白的自闪烁荧光染料，该染料具有自闪烁功能，可以减少dSTORM的应用的激光能量(40W/cm²)。

一种高亮度的用SNAP-tag的自闪烁荧光染料的合成方法，该荧光染料合成路线，如下：

具体合成步骤如下：

(1)中间体1的合成：

将3-甲基-4-溴苯甲酸,N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)，偶氮二异丁氰(AIBN)溶于四氯化碳(CCl₄)中，加热回流40-80h；反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经200-300目硅胶柱以体积比20:1的石油醚和乙酸乙酯为展开剂分离纯化得到白色目标物1；

(2)中间体2的合成：

将中间体1溶于10％碳酸钠溶液中，在70℃搅拌1-4h。反应结束后加入稀盐酸，待沉淀析出后，过滤，干燥；经200-300目硅胶柱以体积比20:1的二氯甲烷和甲醇为展开剂分离纯化得到白色目标物2；

(3)中间体3的合成：

将中间体2，叔丁醇，无水硫酸镁，浓硫酸溶于二氯甲烷中，室温搅拌24-72h天。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经200-300目硅胶柱以体积比100:1的石油醚和乙酸乙酯为展开剂分离纯化得到无色油状目标物3；

(4)中间体4的合成：