[发明专利]一种单细胞内多种蛋白同时定量检测系统及方法

说明书

本发明提供了一种单细胞内多种蛋白同时定量检测系统，包括：微流控芯片装置，包括衬底和微通道，微通道与衬底组成压缩通道，其中，衬底上设有遮光材料组成的透光缝；荧光采集装置，包括荧光显微镜、多通道光路探测器以及数据采集卡，其中，荧光显微镜设有光源，以使细胞内的蛋白接收激光后产生发射光，多通道光路探测器接收发射光，根据发射光的波长将发射光分为多个波段，并将多个波段分别转换为对应的多个电信号脉冲，数据采集卡用于对多个电信号脉冲进行数字化处理得到多个数字化脉冲信号；信号采集和数据处理装置接收存储多个数字化脉冲信号并计算多个蛋白的浓度及数量。另一方面还提供了一种定量检测方法及微流控芯片装置的制作方法。

技术领域

本发明涉及检测技术领域，尤其涉及一种单细胞内多种蛋白同时定量检测系统及方法。

背景技术

蛋白质存在于一切生物体中，是所有生命活动的基本要素，主导细胞执行生理学功能，参与到细胞生命中的各个环节，与细胞功能状态有着深层次的联系。蛋白质数量是反映生命活动变化的主要指标之一，单细胞水平的蛋白质定量检测结果能够揭示出细胞群体中单个或稀有细胞之间蛋白质数量的差异，进而精细地反映生命事件的发生过程，因此在癌症诊疗、感染与免疫、神经传导等领域具有重要意义。

传统的细胞蛋白质定量检测方法如凝胶电泳、免疫分析、质谱等技术，大多是针对群体细胞采集数据，检测结果反映了蛋白平均表达水平。然而，生命体内甚至遗传物质相同的细胞之间都存在差异(即异质性)，在细胞群体水平上的研究结果可能会忽略这种差异，致使某些重要的分子机制被隐藏起来，这意味着在单细胞水平测得的数据更能够精确地反映生命事件的真实情况，单细胞蛋白定量检测技术对于深入理解生命活动过程具有重要意义，而对多种蛋白定量检测的同时表征更能对单细胞有全面的认识，因此研制一种基于微流控技术的单细胞内多种蛋白同时定量检测系统，是有极大的科研和应用潜力的。

目前来说，可将单细胞蛋白检测方式分为传统方法和基于微流控技术的新方法。

其中，(一)传统技术包括荧光流式细胞术、质谱流式细胞术、毛细管电泳方法、酶联免疫斑点检测法。

荧光流式细胞术(Florescence Flow Cytometry，FFC)是目前最主要的单细胞蛋白检测方法，它基于荧光标记对液流中排成单列的细胞等逐个进行快速定量分析及分选。然而，荧光流式细胞术对单细胞内部蛋白检测时，在亮度标定时需使用可以等效的内部修饰有荧光分子的标准微球与之比较荧光亮度，但是这种定量修饰技术目前并不成熟，因此流式细胞术无法用于单细胞内蛋白的绝对定量检测。

质谱流式细胞术(Mass Cytometry)是流式细胞技术与质谱技术的结合，采用重金属元素标记细胞中特定蛋白，经质谱仪检测将原子质量谱的数据转换为单个细胞待测蛋白相对含量。但是该方法具有细胞设备结构和操作复杂、价格昂贵的缺点，并不利于推广使用。

毛细管电泳(Capillary Electrophoresis)是利用高压直流电场(0～30kV)对毛细管(直径小于100μm)内样品分离并检测的技术。毛细管电泳利用毛细管和电泳技术具备了单细胞操纵和蛋白分离能力，具有高灵敏度、超低进样量、多组分分析的特点。但是受限于进样方式，毛细管电泳很难实现对大量单细胞的快速检测。

酶联免疫斑点检测(Enzyme-linked Immunospot Assay，ELISpot)是一种检测单细胞外分泌蛋白的技术。利用底面修饰有特异性抗体的多孔板培养细胞并施加特定刺激，细胞的外分泌蛋白被抗体捕获，再经过显色反应，即可在细胞位置处呈现出斑点，斑点的数目反映了分泌该蛋白的细胞数目，由此可对相应的单细胞比例进行评估。检测灵敏度高，但该方法不能对单个细胞中的蛋白分泌量进一步分析。

(二)基于微流控技术包括片上流式法、微孔阵列法、微通道阵列法和单细胞蛋白印迹法。