[发明专利]来源于褶纹冠蚌基因的病毒型重组溶菌酶

说明书

本发明公开了一种来源于褶纹冠蚌基因的病毒型重组溶菌酶，所述重组溶菌酶的编码序列为SEQ ID No.1所示核苷酸序列，所述重组溶菌酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。本发明的重组溶菌酶具有较宽的pH值耐受范围，且对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌均具有抑菌效果，对绿脓杆菌的抑菌效果更明显，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种溶菌酶，特别涉及一种来源于褶纹冠蚌基因的病毒型重组溶菌酶。

背景技术

溶菌酶作为一种具有杀菌作用的天然抗感染物质。有抗菌消肿止痛及加快组织恢复功能等作用，也可与抗菌药物合用治疗病毒感染。临床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔溃疡、水痘、带状疱疹和扁平疣等。溶菌酶可作为防腐剂，应用在食品包装方面。畜牧水产养殖业是我国农业的重要组成部分，当前农村经济的主要增长点之一，但传染性疾病对养殖业造成巨大威胁，制约其发展。针对此问题，现今国内普遍做法是将抗生素与饲料混在一起作为兽药使用。长期使用抗生素存在安全隐患，同时也产生了抗药性等一系列问题，寻找抗生素替代品是解决问题的一条非常有效的途径。

溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)，是一种碱性水溶性蛋白酶。它主要通过切断细胞壁肽聚糖中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂，细菌裂解。溶菌酶可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。大多数溶菌酶对于革兰氏阳性菌的细胞壁破坏性较强，而对革兰氏阴性菌作用很弱。溶菌酶作为非特异性免疫因子，本身是一种天然蛋白质，既不会使病原菌产生耐药性，也不会使动物产生残留问题，是一种安全性很高的饲料酶制剂。

褶纹冠蚌(学名：Cristaria plicata)俗称鸡冠蚌、湖蚌、绵蚌、水蚌等，为蚌科、冠蚌属，淡水底栖贝类，为中国沿海常见种。一般栖息于淡水缓流及静水水域的湖泊、河流以及沟渠和池塘的泥底或泥沙底里。褶纹冠蚌属大个体淡水贝类。成年个体比三角帆蚌的同龄个体大，壳长可达290mm，壳高170mm，壳宽100mm，最大个体壳长可达400mm以上。它壳质较厚，且坚硬壳后背缘向上扩展成巨大的冠，使蚌体外形略呈不等边三角形。壳面为黄褐色、黑褐色或淡青绿色；壳内面珍珠层呈乳白色、鲑白色、淡蓝色或七彩色。该蚌耐污水和低氧能力较强，喜栖于较肥的水域，生活在硬底或泥沙底的河流、湖泊、沟渠等水域中，它比三角帆蚌分布广泛，在我国几乎各地都出产。迄今为止，尚未有关于利用褶纹冠蚌基因开发重组溶菌酶及其抗菌活性的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供来源于褶纹冠蚌基因的病毒型重组溶菌酶，具有较宽的pH值耐受范围，且对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌均具有一定的抑菌效果，具有广泛的应用前景。为进一步研究新型绿色药物提供了参考和理论依据，同时为抗菌治疗提供高效、低毒、不易产生耐药性的药物，为开发具有自主知识产权的饲料添加剂奠定基础。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

来源于褶纹冠蚌基因的病毒型重组溶菌酶，所述重组溶菌酶的编码序列为SEQ IDNo.1所示核苷酸序列。

来源于褶纹冠蚌基因的病毒型重组溶菌酶，所述重组溶菌酶的氨基酸序列为SEQID No.2所示。

来源于褶纹冠蚌基因的病毒型重组溶菌酶的制备方法，包括以下步骤：

(1)从褶纹冠蚌组织中提取样品总RNA；

(2)以提取的样品总RNA为模板进行逆转录获得cDNA文库；

(3)以的cDNA文库为模板进行PCR扩增获得PCR扩增产物；

(4)PCR扩增产物用EcoR I和XhoⅠ酶切，然后与经同样酶酶切的pEQ-30表达载体相连接形成重组质粒；

(5)将重组质粒转化至大肠杆菌BL21DE3中，培养后筛选获得重组菌；