[发明专利]草鱼ATG12多克隆抗体及其制备方法

说明书

草鱼ATG12多克隆抗体制备方法，首先以草鱼肝脏RNA为模板，反转录合成cDNA，再以cDNA为模板通过引物进行PCR扩增回收目的片段，进而构建ATG12/pGEX‑4T‑1原核表达载体；将ATG12/pGEX‑4T‑1原核表达载体转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行处理后超声破碎离心得上清和沉淀，再将沉淀纯化后得纯化后的ATG12融合蛋白；最后将纯化后的ATG12融合蛋白作为抗原与等体积的弗氏完全佐剂进行1：1充分混合乳化，对新西兰纯种大白兔进行免疫后提取其心脏采血，分离血清，得到ATG12多克隆抗体，该抗体具有特异性高、成本低、周期短的优势，为获得可商品化的ATG12抗体奠定基础。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种草鱼ATG12多克隆抗体及其制备方法。

背景技术

自噬是大部分真核细胞中普遍存在的一种依赖溶酶体的细胞代谢途径，通过降解细胞内泛素蛋白或受损细胞器，以调节细胞内物质代谢及维持内环境的稳定，在细胞生长、分化、衰老、凋亡中发挥重要作用(Maiuri et al.,2007)。自噬体的形成过程主要涉及两个保守的泛素化结合系统，这两个系统对于自噬体的形成是必需，其中一个泛素化结合系统涉及到ATG12基因，ATG12属于泛素样蛋白家族成员之一，能介导自噬体膜拓展，对自噬的形成至关重要(et al.,2004)，ATG12定位于细胞质和自噬体中，同时介导自噬与凋亡两条通路(Rubinstein et al.,2011)，在自噬过程中ATG12和ATG5的结合是不可逆的，ATG12与ATG5结合后形成ATG12-ATG5偶联蛋白，这个蛋白是参加自噬体形成早期阶段的一个重要蛋白，ATG12-ATG5蛋白主要调控自噬体膜的延伸和包被，在LC3脂质化和定位附着中起关键作用(Dirks-Naylor,2013；Klionsky and Schulman,2014)，ATG12-ATG5蛋白在自噬体形成的上游，在自噬体起始阶段通过与之后的自噬相关蛋白来启动自噬进程。

目前，在人、小鼠、水螅及阿米巴虫已有ATG12基因的报道，但在鱼中尚未有公开相关报道，亦未有关于鱼类ATG12体外表达的任何报道，更无关于鱼类ATG12多克隆抗体的研究。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于提供一种草鱼ATG12多克隆抗体及其制备方法，以解决上述背景技术中的缺点。

本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：

草鱼ATG12多克隆抗体，包括草鱼ATG12核苷酸序列与蛋白序列；

草鱼ATG12多克隆抗体制备方法，具体步骤如下：

(一)分析草鱼ATG12基因克隆及序列

1)提取草鱼肝脏总RNA

2)以步骤1)中获得的RNA为模板，反转录合成cDNA；