[发明专利]一种hiPSCs来源的类自闭症模型的建立方法

说明书

本发明涉及一种hiPSCs来源的类自闭症模型的建立方法，该方法主要步骤为(1)微柱阵列芯片的制备；(2)在芯片上诱导类脑；(3)在诱导阶段初期VPA处理3D类脑。该方法主要将干细胞与组织工程相结合，产生了3D类脑组织，通过施加符合生理浓度的VPA(丙戊酸钠)，模拟有双向情感障碍或癫痫的孕妇服用VPA之后对胎儿脑发育的影响，以此来探究自闭症发生的病理机制。该模型是一种新型的自闭症的体外模型，在可以观察到VPA对胎儿脑发育的形态学变化的同时，可以借助分子生物学等多种手段来探究VPA增加胎儿自闭症风险的致病机制。这样可以消除动物实验带来的种属差异以及细胞实验的简单以及2D条件的不足，为探究自闭症的发生提供了一种新的模型与思路。

技术领域

本发明属于器官芯片技术，具体涉及一种hiPSCs来源的类自闭症模型的建立方法。

背景技术

自闭症是广泛性发育障碍的一种亚型，起病于婴幼儿期，主要表现为不同程度的言语发育障碍、人际交往障碍、兴趣狭窄和行为方式刻板。孕期服用VPA会增加胎儿患自闭症的风险。目前对自闭症的研究大都集中在动物模型或二维细胞体外模型。由于小鼠与人之间的种属差异，以及2D培养的简单性，亟待需要一种3D的人源模型。近几年来包括神经干细胞、肠干细胞、胚胎干细胞以及iPSCs来源的类器官得到了有效发展。类器官的特点在于：通过重塑成人干细胞的器官再生或多能干细胞的器官发育，可以准确地代表器官的组织学和生理学。其中体外hiPSCs来源的3D脑基本复制了胎儿早期脑发育的过程，并且这一技术已经广泛的用于构建疾病模型，包括小头症，以及寨卡病毒感染等等。

目前看来，类器官技术还有其不足以及需要改进的地方。由于类器官是3D的细胞团结构使得内部组织容易缺乏氧气和营养，出现细胞死亡，因此限制体外器官的发育。基于此，需要结合其他技术来解决这一问题。此外，使用现有的传统细胞培养技术培养类器官操作复杂，消耗时间长，可控性差。通过微流控技术制备的微柱阵列芯片有利于类脑组织的气体交换与营养交换，除此之外微流控技术还可以提供更加符合生理的因素，例如流体等。

基于此，我们利用高通量的微柱芯片在施加流体的情况下，产生了3D脑类器官，并在特定的时期施加VPA以此来探究VPA增加自闭症的致病机制。

发明内容

本发明的目的是建立一种生命早期类自闭症体外模型，该方法使用微流控芯片产生3D类脑器官，不仅可以提供流体，而且小柱的结构有利于类脑器官之间的气体与营养交换，我们可以实时动态监测，类脑器官的发育，同时探究VPA对类脑器官的形态学、分子以及细胞水平的影响，以此探究VPA增加自闭症风险的致病机制。

本发明提供了一种hiPSCs来源的类自闭症模型的建立方法，其步骤主要分为三部分：

(1)高通量微柱芯片的制备；

(2)在芯片上产生脑类器官；

(3)在诱导阶段初期VPA处理3D类脑；

所述的微柱阵列芯片是由芯片外围坝结构包围微柱结构形成；可用于类器官的生长,微柱结构的直径为500-1000微米，高度为500-100微米，微柱间距为50-100微米，四个微柱结构围成的区域为类脑的形成区域。

步骤(1)高通量微柱阵列芯片的制备，具体为：

(1)使用软蚀刻技术制备SU-8模板，此模板为高通量凹陷小坑，之后对模板进行低粘附修饰，保证SU-8模板与PDMS聚合物容易分离；

(2)制作高通量阵列微柱结构的PDMS聚合物芯片：将PDMS与引发剂184按照体积比10～14：1混成均匀相，之后浇注到SU-8模板上，抽真空去除泡沫，置于80℃烘箱固化20-120分钟，常温将带有结构的PDMS芯片与SU-8模板分离，得到高通量的微柱阵列PDMS芯片；

(3)在PDMS芯片周边用相当大小的石英环将结构封闭，放于80℃烘箱内加热至凝固，得到微阵列芯片。