[发明专利]一种植物抗病相关激素的多位点检测方法

说明书

本发明提供了一种植物抗病相关植物激素的多位点检测方法，本发明采用碳基材料修饰的平板工作电极检测植物抗病相关植物激素的分布情况，具有步骤包括电极的制备、植物样品的微取样和植物激素的电化学检测。用本发明的该方法消除了复杂的和耗时的样品处理过程，可以实时、微量实现植物组织如番茄叶片中生长素和水杨酸的检测，有助于研究二者在植物抗病中的互作关系。

技术领域

本发明涉及一种生物检测方法，具体涉及一种植物抗病相关激素的多位点检测方法。

技术背景

植物在生长发育的过程中，常受到多种病原微生物如病毒、细菌、真菌的侵袭，这些胁迫通常会造成植物细胞的损伤，进而严重影响植物的生长发育和作物产量。在长期的进化过程中，植物在抗病方面形成了自己特有的规律，其依赖自身每一个细胞所具有的天然免疫系统以及从病原菌侵染位点发出的系统性信号，产生相关信号分子，在植物体内有效传递，使整株植物产生系统获得性抗性或诱导性系统抗性，进而使整个植株对入侵病害产生高效持久的抵抗能力。作为信号分子的植物抗病相关激素，在抗病反应的过程中活化植物防卫反应基因的协同表达，从而激活植物的整体抗病防卫反应。

在植物免疫反应中具有重要作用的植物内源激素有水杨酸（SA）、吲哚乙酸等，其在植物中含量极微，但对植物的抗病行为具有极为重要的调节功能。水杨酸是植物体内普遍存在的具有酚类结构的一种小分子化合物，植物先天免疫和系统获得性免疫的形成都需要水杨酸的参与。此外，水杨酸还可以激活植物细胞发生程序化死亡，以阻止病原物扩散到邻近的健康细胞，诱导一系列防卫反应的发生，进而引发整株植物对病原物的抗性。生长素常被认为扮演毒力因子的角色，许多植物病原体通过操纵植物生长素（IAA）合成来介入植物的正常发育过程，感染病原菌后植物体内增加的 生长素水平可能给植物的细胞信号途径和生理带来一系列的变化如引起细胞壁的松弛、细胞膜渗透性的增加、气孔的开放，从而导致病原菌进出植物细胞畅通无阻，加速病原菌的传播。

需要强调的是，当植物感应病害侵袭后，会将用于生长和发育的能量与资源运输到免疫系统，为了节省能量和资源以维持植物正常的发育，植物激素信号路径间可以偶联成复杂的网络，灵活搭配不同激素的组合、精密控制激素水平以及信号的传导，为植物提供了强有力的调控潜能，并促使植物针对入侵者定制最适合的防御反应。植物抗病相关激素水杨酸和生长素，在植物防御反应的过程中存在交叉，目前的研究发现 水杨酸 能通过抑制 生长素 信号途径，如 TIR1 受体基因的全面抑制，增加Aux/IAA 抑制蛋白的稳定性，减少了对生长素的应答，进而影响植物或病原体生长，生长素信号的抑制效应是水杨酸参与抗病反应的一个重要组成部分。

尽管目前研究表明水杨酸和生长素间的相互作用、抗病信号的启动时机和顺序可能由它们在植物体内的相对浓度决定，但目前仍然缺乏直接的实验证据。而这些证据很大程度上源于确定水杨酸和生长素在植物体内的浓度分布及其动态变化。这些问题的真正解答在很大程度上取决于上述植物激素在植物体抗病不同部位的浓度分布及其动态变化。因此，其原位、实时、同步检测已成为抗病调控网络机制研究中的关键。

植物激素目前的检测较多采用气质联用或液质联用等技术进行。这些方法的主要局限于检测前需要复杂耗时的样品前处理，其原因是植物组织与细胞需要进行冷冻破碎以及样品抽提和纯化。由于上述植物激素为易于发生氧化还原反应的小分子，复杂的样品处理过程会导致这些小分子的损失，使得其浓度降低，检测限难以进一步提高。更为重要是，复杂的样品处理过程一般使用较多量的植物样品、且需要较长的时间，难以真实再现植物激素原位实时的浓度，使得我们难以获得准确及时的信息，致使水杨酸与生长素在植物体内的形成及传导过程，以及其在植物抗病机制中的作用研究难以深入进行。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种植物抗病相关植物激素的多位点检测方法，主要包括电极制备、标准曲线的制备、植物样品取样及样品中相关植物激素含量测定，其创新点在于：本发明的电极采用碳基材料制成，本发明的植物样品取样方法为微取样，本发明的相关植物激素含量测定方法采用电化学检测，具体内容如下：