[发明专利]一种人乳寡糖的快速轮廓分析方法

说明书

本发明涉及一种人乳寡糖的快速轮廓分析方法。其特征是：样品经过低温离心脱脂，加入有机溶剂沉淀除蛋白后，经亲水作用色谱柱分离，以质谱为检测器，得到人乳寡糖组成、结构和含量信息。该方法具有选择性高，稳定性好，操作简便可控，通量高等特点，适用于人乳样品的快速、高通量分析。

技术领域

本发明涉及一种人乳寡糖快速轮廓分析方法。其特征是：样品经过低温离心脱脂，加入有机溶剂沉淀除蛋白，再经亲水色谱柱分离分析，质谱检测，获得结构组成分析。该方法具有选择性好，稳定性好，操作简便可控，通量高等特点，适用于大量人乳样品的快速分析。

技术背景

人乳作为婴儿出生时唯一的食物来源，一方面其几乎含有婴儿所必须的所有营养物质，如蛋白质、脂肪、碳水化合物以及微量的矿物质元素和维生素等，另一方面人乳对婴儿完善免疫系统、生长发育等方面具有重要的作用，而这些功能的实现与人乳中的寡糖组分密切相关。人乳寡糖结构由5个基本糖单元组成，即葡萄糖(Glc)，半乳糖(Gal)，N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，岩藻糖(Fuc)和唾液酸(N-乙酰神经氨酸-Neu5Ac)组成。这些寡糖一般在还原末端有一个乳糖，在乳糖的非还原端被不同数量的Galβ1-3GlcNAc(Type I)或Galβ1-4GlcNAc(Type II)单元分别以β1-3或β1-6方式延长成直链或支链寡糖结构，唾液酸和岩藻糖作为修饰的糖在主链上进行了延伸。

研究发现，不同人群中寡糖的种类及含量的差异性与Lewis血型和分泌类型有关。这主要取决于人乳中岩藻糖化寡糖的种类及浓度变化与体内基因调控的糖基转移酶有关。对于分泌型的人群来说，体内含有FucT 2基因，转移Fuc以α1-2方式到末端的Gal上。因此，在分泌型人群的母乳中，存在含有Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc残基的复杂寡糖，而非分泌型的人群中，则没有该类型的寡糖。对于Lewis表现型人群，体内含有FucT 3基因，编码α1-4Fuc到type I链的GlcNAc残基上，对于Lewis不表达的人群来说则没有该类型的糖。因此，根据母乳中不同的寡糖种类，可以推断母亲的分泌状态和Lewis血型。

深入了解人乳寡糖的生物功能的前提是对寡糖进行组成、结构和含量分析，尤其能够针对不同人群样本可以快速分析其在种类和含量差别。因此，发展一种简单、快速、高通量的人乳寡糖快速轮廓分析方法。然而，由于人乳寡糖种类非常多，不同寡糖的含量差异非常大，如何快速的表征寡糖在不同母乳中的差异性是个非常挑战的工作。

目前，对人乳寡糖分析方法主要有(1)高效阴离子交换色谱方法，该方法主要依赖寡糖标准品，有标准品的样品可以进行定性定量的分析，但寡糖标准品非常难于获取，且针对未知寡糖无法获知结构；(2)采用基质辅助激光电离质谱(MALDI-MS)对样品的寡糖分子量进行表征，但该方法仅能获得分子量的信息，不能得到具体的寡糖结构信息，很难表述出样品差异性；(3)采用液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)，尤其是基于石墨化碳色谱柱的方法，但该方法需要对样品进行衍生化，且不同寡糖在石墨化碳柱上峰重叠比较严重，很难作为一种直观的样品表征方法，比较人群样品的差异性。

本发明设计出一种新的人乳寡糖的轮廓分析方法，采用亲水色谱方法对寡糖进行分离，寡糖在色谱柱上依次按照酸性糖，乳糖、中性糖以及聚合度从小到大的顺序流出，依据寡糖的保留时间和分子量实现了寡糖的分类，同时依据二级质谱给出的特征碎片离子，对寡糖的结构特征进行描述，并通过该特征对寡糖种类进行归属，并依据此可以对母亲的分泌状态和Lewis血型进行区分。

发明内容

本发明涉及一种人乳寡糖轮廓分析方法。本发明特征在于：样品经过离心脱脂、沉淀除蛋白，样品直接经过亲水色谱柱分析，通过质谱检测，获得结构、组成和含量分析。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

样品经过离心脱脂，加入有机溶剂沉淀除蛋白后，经亲水色谱柱分离后进入质谱检测。流动相为有机溶剂和水或有机溶剂和添加剂水溶液，通过优化色谱参数，使用等度或梯度洗脱条件。