[发明专利]一种PCR扩增试剂及其应用

说明书

本发明公开一种PCR扩增试剂及其应用，所述的PCR扩增试剂，在扩增体系中加入反应添加剂，所述添加剂选自甘油、海藻糖、DMSO或明胶中的一种或几种。单独使用一种添加剂有利于提高扩增灵敏度，几种种添加剂结合使用可以更好的提升扩增灵敏度和兼容性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种PCR扩增试剂及其应用。

背景技术

目前高通量测序技术凭借其更低廉的价格，更全面、更深入地对全基因组进行分析的优势已经得到了广泛的应用，在科学研究、疾病诊断和治疗等方面有着重要的意义。在很多实际应用中，并不需要对全基因组进行测序，而只需要分析特定基因组区域。靶向测序技术就是对基因组特定靶向位点进行特异性建库测序的高通量测序技术。目前靶向测序可通过两种方式实现，一是靶向探针捕获测序，二是扩增子测序。扩增子测序是通过设计感兴趣的基因组区域的引物，进行PCR扩增，对目标区域进行富集，针对特定长度的PCR产物进行建库，通过测序分析序列中的变异。采用扩增子测序，研究者可以对基因组中感兴趣的关键区域进行重点研究，该方法可以高效的发现、验证和筛选关注区域的基因组变异。相对于全基因组或全外显子组测序而言，扩增子测序具有针对性强、数据量少、灵活性高、分析简单、测序周期短、测序深度高、成本低等诸多优势。

目标区域富集是通过多重PCR扩增实现，多重PCR(multiplex PCR)的基本原理、反应试剂和操作均与常规PCR相同，区别在于多重PCR体系中含有2对或多对引物，分别扩增不同模板，以对多个靶标进行同时检测，因而多重PCR更为快速、简便。多重PCR体系中多对引物的存在容易引起以引物二聚体为主的非特异扩增的产生，因此，设计引物时应综合考虑引物长度、GC含量及引物与靶序列的同源性。各引物的退火温度应较为接近，以使各引物对其相应的靶序列有相同的扩增效率。由于Taq DNA聚合酶是Mg²⁺依赖酶，dNTP、引物也都依赖于Mg²⁺，所以最佳Mg²⁺浓度对平衡扩增的特异性和灵敏度有很大的影响，通常依据dNTP浓度、模板DNA量及缓冲液组分来确定Mg²⁺浓度。

目前的扩增子测序是通过PCR扩增富集到目标区域后，进行末端修复和加A，加接头，纯化样品，跑胶回收目的条带，PCR扩增，跑胶回收主带，送测序。扩增子建库的成功关键之处在于第一步的目标区域的富集(多重PCR)，获得产量高、均一度好的目标区域才能保证后续顺利构建测序文库。目前很多研究都集中在优化多重PCR过程，期望获得扩增灵敏度高、特异性好、并且能够适用于更多不同样本的多重扩增试剂。

现有的扩增试剂在产物均一度和产量上效果欠佳，表现在针对质量不好的样本，如：福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本、细胞游离DNA(cfDNA)等，以及样本投入量较低(低于0.1ng)时，试剂的灵敏度不够，目标区域得不到较好的扩增。现有的扩增试剂在扩增不同TM值体系时，兼容性较差，这些缺陷都对后续的测序文库构建有很大的影响。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种扩增试剂。

本发明目的之二在于提供所述扩增试剂在生物技术领域中的应用。

本发明的目的可以通过以下方案实现：一种PCR扩增试剂，在扩增体系中加入反应添加剂，所述添加剂选自甘油、海藻糖、DMSO或明胶中的一种或几种。单独使用一种添加剂有利于提高扩增灵敏度，几种种添加剂结合使用可以更好的提升扩增灵敏度和兼容性。

进一步优选的，所述添加剂的加入体积为每个扩增反应的反应体系总体积的0.5～15％，更进一步优选为1～5％，最优选为1～3％；如果是在2×Multi-PCR Mix中，则优选为反应体系总体积的1～30％，更进一步优选为2～10％，最优选为2～6％。