[发明专利]一种荧光检测脂肪酶活性的方法

说明书

本发明属于生物质化学和可再生资源利用领域，具体涉及一种荧光检测脂肪酶活性的方法。本发明将非离子型表面活性剂溶液和姜黄素溶液混合，然后加入可溶性铜盐溶液，得到混合溶液1；将巯基乙酸甲酯溶液和磷酸盐缓冲溶液混合，得到混合溶液2；将混合溶液2和待测脂肪酶样品混合，30～40℃水浴反应10～30min，去除脂肪酶，得到混合溶液3；将混合溶液1和混合溶液3混合，20～40℃反应3～10min；进行荧光检测，然后采用外标法以荧光强度定量待测脂肪酶溶液脂肪酶活性。本发明与现有技术相比，更加灵敏、检测下限更加低，可实现微量级的检测，应用更加广泛。

技术领域

本发明属于生物质化学和可再生资源利用领域，具体涉及一种荧光检测脂肪酶活性的方法。

背景技术

脂肪酶[E.C.3.1.1.3]是重要的工业用酶，能特异性识别羧酸酯中的酯键，并催化水解切割酯键生成脂肪酸和醇，在食品、化妆品、制药以及生物柴油等领域常作为催化剂使用。脂肪酶在生物化工中的大量应用，使脂肪酶活性的检测研究成为基础有机应用研究领域的重要课题。与其它水解酶类(如乙酰胆碱酯酶和碱性磷酸酶)不同，脂肪酶只在油-水界面上才能被活化，是一种界面反应酶，脂肪酶的催化属于异相催化(Heterogeneous-catalyzed)，且不溶于水的脂肪酶底物需要被乳化，乳化剂的加入常会导致分析体系复杂化，产生信号干扰，并对测量的真实性产生重大影响。因此脂肪酶活性的检测与其它水解酶相比更为复杂。传统脂肪酶活性的检测方法，如pH滴定法、浊度法，操作繁琐，耗时较长，灵敏度低。因此，开发高灵敏度、高通量检测脂肪酶活性的分析方法具有重要的实际应用价值。

姜黄素是一种从姜黄根茎中分离出来的天然的二酮类化合物，作为抗癌药物，近年来在细胞培养和医学研究方面得到了较多的应用。姜黄素具有可见光吸收和荧光光谱特性，吸收峰位于410～430nm范围内，荧光发射位于460～ 560nm范围内。近年来，许多研究者利用姜黄素的光谱特性构建生物传感器，但姜黄素水溶性差，在水溶液中稳定性也差，限制了其实际应用。研究表明，姜黄素中的β-二酮结构可与金属离子结合，姜黄素的特征吸收峰位置基本保持不变，但强度发生变化。大豆多糖、磷脂脂质体以及非离子型表面活性剂吐温40和TritonX-100均能作为包封姜黄素的载体，显著提高其溶解性和吸收以及荧光性质。本课题组近年来致力于脂肪酶活性的比色和荧光检测基于姜黄素的特性，汤燕等通过制备吐温40-姜黄素复合物胶束，成功组装了脂肪酶活性检测的荧光法传感器。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的目的在于提供一种荧光检测脂肪酶活性的方法，该方法具有成本低廉、操作简单、灵敏度高的特点，可实现对脂肪酶活性的高通量检测。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种荧光检测脂肪酶活性的方法，包含如下步骤：

(1)将非离子型表面活性剂溶液和姜黄素溶液混合，然后加入可溶性铜盐溶液，得到混合溶液1，其中，姜黄素和可溶性铜盐的摩尔比为1:2；

(2)将巯基乙酸甲酯溶液和磷酸盐缓冲溶液混合，得到混合溶液2；

(3)将混合溶液2和待测脂肪酶样品混合；30～40℃水浴反应10～30min，过滤去除脂肪酶，得到混合溶液3；

(4)将混合溶液1和混合溶液3混合，20～40℃反应3～10min；进行荧光检测，然后采用外标法以荧光强度定量待测脂肪酶溶液脂肪酶活性；

步骤(1)中所述的非离子型表面活性剂为吐温40和TritonX-100中的至少一种；

步骤(1)中所述的非离子型表面活性剂优选为吐温40；

步骤(1)中所述的混合溶液1中非离子型表面活性剂的浓度优选为100～ 500μmol/L；

步骤(1)中所述的混合溶液1中非离子型表面活性剂的浓度进一步优选为 300μmol/L；