[发明专利]一种鉴定哮喘生物标记物的方法及其检测试剂盒

说明书

本发明提供了一种鉴定哮喘的生物标记物的方法及其检测试剂盒。所述生物标记物为血清中经过柱前PMP衍生的高效液相色谱得到的游离甘露糖和葡萄糖以及葡萄糖与甘露糖的比值。本发明检测方法为柱前1‑苯基‑5‑甲基吡唑啉酮(PMP)衍生的高效液相色谱法。本发明的技术方案具有前处理简单，分析时间短，仪器价格合理，符合常规使用，操作步骤简单易学，检测结果准确性高，只需采血便可区分正常人和哮喘患者，并且所需血清量极少，采血量小于1mL等优点。所得结果显示此分析方法可以快速定量哮喘患者血清中游离的甘露糖和葡萄糖，对于研究血清游离甘露糖及葡萄糖与哮喘之间的关系、寻找新型哮喘临床检测标志物有着非常重要的意义。

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种鉴定哮喘的生物标记物的方法及其检测试剂盒。

背景技术

哮喘又名支气管哮喘，是一种常见的呼吸系统疾病；是由多种细胞及细胞组份参与的气道慢性炎症性疾病。全世界约有3亿哮喘患者，已成为严重威胁公众健康的一种主要慢性疾病。在临床上，体检是检查哮喘的方式之一，临床上血液常规检查嗜酸性粒细胞增高、痰液检查嗜酸性粒细胞是否退化形成尖棱结晶，黏液栓和透明的哮喘珠、肺功能检查最大呼气流量以及呼气峰值流量是否减少都是哮喘的检验手段。此外，血气分析是否有呼吸性碱中毒，胸部X线检查患者两肺透亮度是否增加而呈过度充气状态也是常用的方法。上述方法在哮喘发作期都有着相应的检测优势，但在机体无异常体征的缓解期实现哮喘的检测，难度很大，都存在着一定的局限性，尤其是在患者最初尚未明确哮喘时，则更为明显。血液分析有着其方便快捷的独特优势，因此，开发出一种基于血液检测的哮喘生物标志物，对于解决哮喘检测技术的局限，意义重大。

血清中还原性单糖似乎仅限于甘露糖和葡萄。文献报道，哮喘患者血清中，游离的葡萄糖和甘露糖水平比正常人高。人体血清游离单糖中葡萄糖的含量最高，正常人的范围为3.90～6.16mmol/L。目前，医院检验科可以直接通过测生化指标检测葡萄糖浓度，暂时不可以直接检测甘露糖浓度。健康成人血浆中游离甘露糖的浓度范围为20～80μmol/L。甘露糖的含量约为葡萄糖含量的1％。它大部分被认为是由细胞中的葡萄糖异构化而来。而近来有研究表明，细胞中流出的游离的甘露糖是哺乳动物血液中游离甘露糖的主要来源。这两部分来源的游离甘露糖维持着血清中甘露糖的稳定。D-甘露糖是糖蛋白，细胞表面糖缀合物和糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白等结构中必需的单糖。其中，甘露糖是各种多糖复合物中N-糖链的重要组分，N-聚糖中的甘露糖残基来源于血液中的葡萄糖或甘露糖。游离甘露糖是正常的血浆成分。目前，血清甘露糖的测定方法主要有酶法、气液色谱法、高分辨液相层析、气液色谱-质谱法和毛细管电泳法等。但这些方法均存在一定的不足之处。比如，使用酶法、气液色谱法和高分辨液相层析时，为避免高浓度的葡萄糖的影响需要将其去除，致使前处理过程比较繁琐；气液色谱-质谱法仪器价格昂贵，不适合常规目的；所需血清样本量大。

发明内容

本发明的目的是提供了用于鉴定哮喘的生物标记物及其应用，本发明采用柱前PMP衍生的高效液相色谱法(HPLC)检测哮喘患者血清中的单糖，尤其涉及血清中游离甘露糖和葡萄糖的检测。本发明的技术方案可以用于检测哮喘患者或正常人血清游离甘露糖和葡萄糖浓度，可以用于鉴定哮喘患者。

为实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

用于鉴定哮喘的生物标记物，所述生物标记物为血清经过柱前PMP衍生的高效液相色谱得到的游离甘露糖和葡萄糖。

用于鉴定哮喘的生物标记物的定量分析方法，其特征在于：该方法为柱前PMP衍生的高效液相色谱法，包括以下具体步骤：

(1)调节pH为7-14：取待检测的血清样品加超纯水于EP管中，加入氢氧化钠，涡旋混匀；

(2)PMP衍生：每个样品加入PMP，涡旋混匀，离心后置于烘箱反应；

(3)加酸中和反应：将烘箱内的样品取出，放置冷却，每个样品加入盐酸，涡旋混匀；