[发明专利]一种鉴定肺炎生物标记物的方法及其检测试剂盒

说明书

本发明提供了用于鉴定肺炎的生物标记物及其应用。所述生物标记物为患者血清经过柱前1‑苯基‑5‑甲基吡唑啉酮(PMP)衍生的高效液相色谱(HPLC)得到的游离葡萄糖和甘露糖。本发明的技术方案具有前处理简单，分析时间短，仪器价格合理，符合常规使用，操作步骤简单易学，检测结果准确性高，只需采血进行HPLC仪分析便可区分正常人和患者，并且所需血清量极少，采血量小于1mL等优点。所得结果显示此分析方法可以快速分析血清中游离的甘露糖和葡萄糖，并可以计算得到甘露糖、葡萄糖糖浓度及二者峰面积，对于研究血清游离甘露糖和葡萄糖与疾病之间的关系、寻找新型肺炎疾病临床检测的标志物有着非常重要的意义。

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及用于鉴定肺炎的生物标记物及其检测应用。

背景技术

肺炎是一种影响肺部的呼吸道感染，指终末气道，肺泡和肺间质的炎症，可由疾病微生物、理化因素，免疫损伤、过敏及药物所致。细菌性肺炎是最常见的肺炎，也是最常见的感染性疾病之一。引起肺炎的病原很复杂，包括细菌、病毒、支原体等多种，以及放射线、吸入性异物等理化因素引起。临床表现主要有发热，咳嗽，咳痰，呼吸困难，肺部X线可见炎性浸润阴影，可伴胸痛或呼吸困难等。幼儿性肺炎，症状常不明显，可有轻微咳嗽。对于肺炎的诊断，胸腔X光照射肺部出现浸润现象是诊断肺炎的黄金标准，支持性的诊断方法则是由病患的痰液或血液进行微生物的培养。肺炎影响全球约4.5亿人(占总人口的7％)，导致每年约400万人死亡。随着20世纪抗生素和疫苗的引入，肺炎生存率得到改善。然而发展中国家，仍然是导致婴幼儿、中老年人和慢性病患者等死亡的主要原因，也被称为“老人的朋友”。目前日常诊疗对肺炎的病因诊断和严重程度评估不够，应进一步重视分层诊断，及早识别高危患者，提出合理治疗方案。因此，建立可靠的肺炎早期诊断筛查方法具有较好的临床意义。如何精确识别肺炎的人群以便早期干预，或能否筛选合适的生物标志物以预测疾病治疗的效果或者预测疾病的进展等值得研究。

血清中还原性单糖似乎仅限于甘露糖和葡萄。人体血清游离单糖中葡萄糖的含量最高，正常体检人群的范围为3.90～6.16mmol/L。目前，医院检验科可以直接通过测生化指标检测葡萄糖浓度，暂时不可以直接检测甘露糖浓度。健康成人血浆中游离甘露糖的浓度范围为 20～80μmol/L。甘露糖的含量约为葡萄糖含量的1％。它大部分被认为是由细胞中的葡萄糖异构化而来。而近来有研究表明，细胞中流出的游离的甘露糖是哺乳动物血液中游离甘露糖的主要来源。这两部分来源的游离甘露糖维持着血清中甘露糖的稳定。D-甘露糖是糖蛋白，细胞表面糖缀合物和糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白等结构中必需的单糖。其中，甘露糖是各种多糖复合物中N-糖链的重要组分，N-聚糖中的甘露糖残基来源于血液中的葡萄糖或甘露糖。游离甘露糖是正常的血浆成分。目前，血清甘露糖的测定方法主要有酶法、气液色谱法、高分辨液相层析、气液色谱-质谱法和毛细管电泳法等。但这些方法均存在一定的不足之处。比如，使用酶法、气液色谱法和高分辨液相层析时，为避免高浓度的葡萄糖的影响需要将其去除，致使前处理过程比较繁琐；气液色谱-质谱法仪器价格昂贵，不适合常规目的；所需血清样本量大。目前没有文献报道柱前1-苯基-5-甲基吡唑啉酮(PMP)衍生的高效液相色谱法同时检测肺炎患者血清中游离的甘露糖和葡萄糖。

因此，建立高效准确的血清中游离甘露糖的检测方法，对于研究血清游离单糖与疾病之间的关系、寻找疾病临床检测的标志物有着非常重要的意义。

单糖的PMP衍生法是目前较为常用的单糖检测方法。该方法包括以下几个步骤：(1) 为PMP创建碱性条件，(2)加入PMP，在70℃进行衍生，(3)调节衍生后的溶液pH，将残余PMP萃取出来。发明专利CN 103969371 B公开了“一种血液降解得到并检测单糖的方法在癌症检测中的应用”。该发明专利首先将血清样品通过酸降解，将其中的多糖和糖蛋白降解为单糖组分；然后经过PMP衍生和高效液相对降解后得到的8种单糖进行检测。相比降解前的血清，样品组分与性质已经发生巨大变化。虽然单糖的PMP衍方法在各个领域应用比较广泛，但目前尚无报道将该方法应用于肺炎患者的血清中游离甘露糖和葡萄糖的检测。

发明内容