[发明专利]一种观察微小组织内细胞立体分布及统计细胞数目的方法

说明书

本发明涉及生物组织的微观观察技术领域内一种观察微小组织内细胞立体分布及统计细胞数目的方法，将获取的待观察组织材料进行表面清洗后依次进行化学固定、脱水处理、免疫荧光染色和透明化处理；再将组织材料连同透明液移至共聚焦显微镜专用培养皿，用激光共聚焦显微镜进行逐层扫描拍照，获得整体组织各层的细胞分布图像，进行细胞立体分布的观察，再通过Imaris软件处理各层细胞分布图像数据，重建细胞组织的三维模型，观察三维立体模型中被免疫荧光标记细胞的立体分布，再利用Imaris Bitplane Spot检测分析，计算出免疫荧光标记细胞的准确数目。本发明的方法保持了待观察组织的完整性，而且观察细胞分布的清晰度和准确度都高，细胞的数目统计结果更准确。

技术领域

本发明涉及生物组织的微观观察技术领域，特别涉及一种观察微小组织内细胞立体分布及统计细胞数目的方法。

背景技术

在生命科学研究和临床病理学分析中，观察生物组织中细胞的微观分布和统计细胞数目，对研究细胞分化、组织发育、疾病发生等具有非常重要的意义。研究这一过程的常规方法是对组织进行连续切片后，利用免疫组织化学染色，然后通过不同切片间的图像数据拼接和叠加来模拟和推测出完整组织中细胞的分布，进而推算特定细胞的数目。但是，这一常规方法的局限性是，连续切片并不能完全显示真正的组织全貌、细胞分布和特定细胞数量。组织切片只能显示某一个层面的细胞分布和数量，况且在实际制作切片时，很难避免对组织的破坏和丢失，无法保证单个切片细胞分布和数量的准确性，同时，也很难保证不同切片厚度的均一性，这就导致叠加后的结果更加不准确，即便是用数学模型来重建和计算，其最终的结果也只是预测和估算而已，并非真实的图像和数据，这就造成同样的生物组织样品，最后结果的可变系数非常大，特别是细胞数量的结果可信度不高。

如何在保持组织完整性的同时，观察特定细胞在组织内部的分布和数量，是生物学研究和医学研究的一个重点和热点。虽然，现在临床医学常用的计算机断层扫描（CT），正电子发射计算机断层扫描（PETCT）, 核磁共振成像（MRI）等技术得到了快速发展，但到目前为止，其分辨率仍达不到细胞水平或亚细胞水平。

发明内容

本发明的目的是，提供一种保持组织完整性的同时观察微小组织内细胞立体分布及统计细胞数目的方法，为生命科学研究和临床病理学分析提供一种在细胞水平或亚细胞水平观察组织和统计细胞数量的方法。

为实现本发明的上述目的，本发明首先提供一种观察微小组织内细胞立体分布的方法，包括以下步骤：获取待观察的组织材料并进行表面清洗；对所获取的组织材料进行化学固定和脱水处理；对脱水处理后的组织材料进行免疫荧光染色；对免疫荧光染色的组织材料进行透明化处理；将透明化处理的组织材料连同透明液移至共聚焦显微镜专用培养皿，用激光共聚焦显微镜进行逐层扫描拍照，获得整体组织各层的细胞分布图像，进行细胞立体分布的观察。

本发明的方法，通过对整体生物组织进行化学固定、脱水处理、免疫荧光染色和透明化处理，保持获取的整体生物组织的完整性，对组织内的特异性细胞进行识别和荧光标记以便于观察，然后通过激光共聚焦显微镜进行逐层扫描拍照，获得整体组织各层的细胞分布图像，进行细胞立体分布的观察。本发明的方法中对生物组织的整体处理和观察过程，保持组织整体的完整性，不需要分层切片观察，实现细胞水平或亚细胞水平的高分辨率精确观察。

作为本发明的优选，所述组织材料的厚度小于500μm，所述逐层扫描拍照的层厚间距为1～5μm。

本发明的组织材料的化学固定步骤包括：组织材料的化学固定步骤包括：在2～5℃的条件下将冲洗后的组织材料浸泡在质量浓度为3.5～4.5%多聚甲醛水溶液中固定2～2.5小时；之后，移除多聚甲醛水溶液，在2～5℃的条件下，将组织材料分别用磷酸缓冲液进行振荡洗脱3～4小时，所述磷酸缓冲液每隔1小时更换一次。通过本步的处理，降低组织中蛋白质、肽类物质等多种物质的水溶性以便于将组织材料进行硬化固定，保证整体组织的完整性。