[发明专利]壳寡糖包被绵羊李斯特菌、制备方法及应用

说明书

本发明涉及一种壳寡糖包被绵羊李斯特菌、制备方法及应用，是壳寡糖通过静电吸附作用包被在绵羊李斯特菌表面而得，壳寡糖与绵羊李斯特菌的配比小于等于2mg∶1×10⁸CFU。本发明将佐剂壳寡糖通过静电吸附作用包被到绵羊李斯特菌表面，包被方式简单，在筛选出的包被液浓度范围内壳寡糖不影响细菌生长。包被在细菌表面的壳寡糖所带的正电荷中和了细菌表面所带的负电荷，形成的复合物(包被后的细菌)更容易靠近带负电荷的吞噬细胞，细菌入胞率得到显著提高。更多细菌进入吞噬细胞、树突状细胞等抗原递呈细胞能产生更强的抗原刺激，诱导更强的免疫应答。

技术领域

本发明属于生物领域，涉及一种壳寡糖包被绵羊李斯特菌、制备方法及应用。

背景技术

绵羊李斯特菌(Listeria ivanovii，LI)属于李斯特菌属，可在巨噬细胞和许多非吞噬细胞(如上皮细胞、内皮细胞和肝细胞)内增殖，在此过程中，可同时经MHC I类和MHCII类途径递呈细菌携带的抗原，因而可用作构建疫苗的活菌载体。将外源抗原加入该菌后，通过该菌在抗原递呈细胞内的短暂增殖，将外源抗原递呈给淋巴细胞，有效激活免疫应答，尤其是细胞免疫应答，发挥疫苗免疫作用。同时，该菌对人不致病，仅主要感染以绵羊为主的畜类，因而对人安全。有研究者以LI为疫苗载体构建了两株携带结核分枝杆菌抗原的重组菌，免疫小鼠后抗原特异性细胞因子IFN-γ分泌上调，证实了LI作为疫苗载体的可行性。但已有的研究表明，LI逃逸吞噬细胞吞噬体和在胞浆内聚焦肌动蛋白的能力，以及免疫小鼠后诱导的细胞因子反应均较弱，故LI疫苗载体可能需要联合使用佐剂以获得更强的特异性免疫应答。

壳寡糖(Chitooligosaccharide，COS)是由壳聚糖降解产生的分子量小于5000的低聚糖，是一种带正电荷的生物活性材料，可用于药物递送和基因转导，壳寡糖具有多种生理活性，其中最重要的是它的免疫增强作用。有研究者将带正电荷的壳寡糖通过静电吸附作用包被于带负电荷的腺病毒疫苗载体表面，发现可明显提高腺病毒疫苗诱导的特异性IFN-γ的分泌。细菌与病毒在大小、结构、形态上差别很大，生物学特性也极为不同，高浓度的壳寡糖对细菌具有较强的毒性，壳寡糖浓度过低又不能保证包被效果。壳寡糖能否包被于细菌表面，以及包被后能否增强细菌的免疫原性还未有研究报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种壳寡糖包被绵羊李斯特菌、制备方法及应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

壳寡糖包被绵羊李斯特菌(Listeria ivanovii，LI)，是壳寡糖通过静电吸附作用包被在LI表面而得，壳寡糖与LI的配比小于等于2mg∶1×10⁸CFU。

作为优选的技术方案之一，壳寡糖的分子量为3000Da。

上述壳寡糖包被LI的制备方法，步骤如下：

(1)将LI配制成浓度为1×10⁸CFU/mL的菌悬液；

(2)菌悬液与浓度小于等于2mg/mL的壳寡糖溶液等体积混合，振荡混匀，静置，离心，弃上清，洗涤，重悬，即得。

优选的，步骤(1)的具体方法是：冻存的LI菌株经复苏、二次复苏、接种培养，取所得的菌液制成菌悬液。

进一步优选的，接种培养至菌液在600nm的吸光度值A₆₀₀为0.3～0.8之间，根据测定的LI A₆₀₀值与LI菌液浓度的关系确定此时的LI菌液浓度，A₆₀₀值与LI菌液浓度的关系为：LI(CFU/mL)＝3A₆₀₀×10⁹-2×10⁸，其中，LI表示LI菌液浓度，取LI菌液配制菌悬液。