[发明专利]用于敲除Egr3基因的腺相关病毒重组载体及其构建方法和用途

说明书

本发明提供一种用于敲除Egr3基因的腺相关病毒重组载体及其构建方法和用途，载体至少包括：如下可操作性连接的序列元件：5’末端反相重复序列，CMV启动子，sacas9编码序列，polyA信号序列，U6启动子序列，gRNA序列，3’末端反相重复序列。腺相关病毒重组载体载体可以高效的敲除Egr3。经过发明人研究发现，Egr3基因敲除载体可以有效抑制HepG2细胞肝癌模型的移植瘤生长及肿瘤血管生成。说明本发明的技术方案可以适用于肝癌疾病的治疗。

技术领域

本发明涉及一种用于敲除Egr3基因的腺相关病毒重组载体及其构建方法和用途，属于生物技术领域。

背景技术

Egr3属于Egr(早起生长反应因子)家族成员，属于转录因子家族成员的即可反应因子，主要参与调解细胞的生长、增殖、分化和凋亡过程

腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)，是微小病毒科依赖病毒属，病毒颗粒大小约为20～26nm，完整的生活周期需要辅助病毒(通常为腺相关病毒或疱疹病毒)参与。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。其中cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。AAV有多种血清型，不同血清型对不同组织的亲和力不同，适用于各种体内感染实验。由于AAV的安全性能好和表达时效长的优点，目前已成为最有前景的基因治疗工具。

AAV包装系统分为3质粒，其中包括可以插入外源基因的穿梭质粒，以及编码rep和cap蛋白编码基因的pAAV-RC，以及替代腺相关病毒所依赖的腺相关病毒的pHelper质粒。3种质粒共转染工具细胞AAV-293后，可以形成携带有外源插入基因的AAV病毒颗粒。

CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats)是近期出现的一种由RNA指导的Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。在这一系统中，crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点切断双链DNA。在基因组编辑过程中，tracrRNA和crRNA可以融合成为1条RNA(sgRNA)表达同样可以起到靶向剪切的作用。

1971年，Judah Folkman博士首次提出了“肿瘤生长依赖于血管生成(tumorangiogenesis)”的观点：一旦肿瘤发生，任何数量的肿瘤细胞增加，都必将伴有新毛细血管的形成。新生血管通过灌注形式为肿瘤细胞生长提供营养供给,同时它也是肿瘤细胞代谢产物排泄的有效途径；而在没有血管形成的情况下，肿瘤的营养供给及代谢物排泄仅能靠简单的物理弥散。这就是严重地限制了肿瘤细胞的生长。

肿瘤的生长和转移与肿瘤血管有着密切的关系。实体瘤大概在1～2mm大小时无新生血管，供给其生长的营养依赖于周围组织的弥散作用，生长极缓慢或处于“休眠”状态。当肿瘤进一步增长时新生血管形成是必要的，癌细胞从供应血管中不断摄取营养物质与氧，运走代谢产物，满足肿瘤细胞生长的需要。此时肿瘤的营养供应由弥散变为灌注，该阶段肿瘤快速增长并具有转移能力。目前抑制肿瘤血管的形成可作为肿瘤治疗的一种重要手段。

本领域技术人员一直致力于开发能够有效治疗肿瘤的基因技术。现有技术中问题是缺少有效治疗肝癌的基因手段和方法。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种Egr3基因敲除载体及其构建方法和用途。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种用于敲除Egr3基因的腺相关病毒重组载体，所述腺相关病毒载体至少包括如下可操作性连接的序列元件：

5’末端反相重复序列，CMV启动子，sacas9序列，polyA信号序列，U6启动子序列，gRNA序列，3’末端反相重复序列。