[发明专利]一种建立缺氧损伤细胞模型的方法

说明书

本发明公开了生物医药技术领域的一种建立缺氧损伤细胞模型的方法，该建立缺氧损伤细胞模型的方法步骤如下：S1：细胞培养；S2：细胞铺板；S3：培养基更换；S4：细胞缺氧培养：在培养容器上覆盖一层透气膜，置于含有一定气体组分的模块化培养小室中培养；S5：细胞检测。本方法所建立的缺氧损伤细胞模型，不需要实验动物参与，建模成本低，对于缺氧应激反应更加灵敏，能够在分子生物学水平上探讨缺氧损伤，能够为模拟缺氧实验的进行以及抗缺氧药物的筛选和验证提供条件。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体为一种建立缺氧损伤细胞模型的方法。

背景技术

缺氧是指因组织的氧气供应不足或用氧障碍，而导致机体的代谢，功能和形态结构发生异常变化的病理过程。脑，心脏等生命体重要器官缺氧也是导致机体死亡的重要原因，另外，由于动脉血氧含量明显降低导致的组织供氧不足会导致低血氧症。

机体正常的生命活动都离不开氧气，从细胞的新陈代谢到心脏跳动都与氧气密切相关。机体吸入氧气，并通过血液到达组织，最终被细胞所感受和利用，因此，缺氧的本质是细胞对低氧状态的一种反应和适应性改变，当急性严重缺氧或者中毒性缺氧时，细胞变化以线粒体能量代谢障碍为主，慢性轻度缺氧时细胞以氧感受器的代偿性调节为主。

随着对缺氧认识和研究的深入，探讨缺氧造成的病理性损伤机制与药物对其作用的靶点，越来越需要在分子生物学的水平上阐明缺氧的细胞损伤机制。缺氧性细胞损伤主要以细胞膜，线粒体，溶酶体等细胞器为主。细胞内严重缺氧时造成ATP减少，细胞内膜对离子通透性升高，导致离子顺浓度差透过细胞膜，钠离子内流从而造成细胞水肿。血管内皮细胞水肿会堵塞微血管，进一步造成微循环缺氧，同时钾离子外流，导致细胞合成代谢障碍，酶的生成减少，将进一步影响ATP的生成和离子泵的功能。当线粒体部位氧分压降到监界点0.1kPa（＜1mmHg）时，线粒体的呼吸功能降低，关键脱氢酶活性下降，ATP生成减少。严重时线粒体可出现肿胀、嵴崩解、外膜破裂和基质外溢等病变。缺氧时因糖酵解增强，乳酸生成增多，以及脂肪氧化不全使其中间代谢产物酮体增多。导致酸中毒。pH降低可引起磷脂酶活性增高，使溶酶体膜磷脂被分解，膜通透性增高，结果使溶酶体肿胀、破裂，和大量溶酶体酶的释出，进而导致细胞本身及其周围组织的溶解、坏死。

高原是一种特殊的地理环境，其主要环境特征即为低压低氧。随着高原旅游的热潮，国家发展战略的实施等诸多原因，由平原急进入高原地区的人群逐渐增加，基于上述缺氧造成的细胞损伤机理，部分人体在急进高原后出现严重的急性高山病症状，包括高原脑水肿，肺水肿等，严重时危及生命。

目前急性高山病发病机理复杂，制约了高原合理用药以及相关药物的研发。对缺氧损伤病理机制的研究更需要在在缺氧模型的基础上进行探讨。对现有技术来说相关的抗缺氧药物的都基于动物实验进行研发，如专利申请号201610616740.7公布的Atropurpuran衍生物组合物在抗缺氧药物中的应用，其中具体实施例中所提到的缺氧模型使用的是昆明系小鼠，这对动物造成损害。另外以也有直接将细胞置于低氧环境下培养，模拟缺氧状态的模型，但这种模型的缺点在于，细胞本身较为敏感，其正常需氧量在1%~5%，由于细胞培养瓶在放入缺氧环境中时，瓶中就含有正常大气中21%的氧气，且培养瓶为密闭，无菌环境，其中所含氧气足以维持细胞在一定时间内的正常生存环境，这种细胞模型并不能灵敏地反映细胞缺氧损伤，因此，需要一种更加方便，精准的筛选或验证治疗缺氧损伤的药物试剂的方法，并且必须建立在分子生物学水平上探讨缺氧损伤，才能为模拟缺氧实验的进行以及抗缺氧药物的筛选和验证提供条件。

发明内容

本发明的目的在于提供一种建立缺氧损伤细胞模型的方法，以解决上述背景技术中提出的需要更加灵敏，简单，稳定的优势，能够快速模拟细胞缺氧环境，反映急进缺氧环境后细胞周围的氧分压变化以及细胞损伤的状态方法的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种建立缺氧损伤细胞模型的方法，该建立缺氧损伤细胞模型的方法步骤如下：