[发明专利]一种构建番鸭呼肠孤病毒反向遗传系统的方法

权利要求书

1.一种构建番鸭呼肠孤病毒反向遗传系统的方法，其特征在于包括下述步骤：

（1）提取MDRV 基因组RNA；

（2）以步骤（1）的RNA作为模板，用引物进行PCR扩增，得到相应的基因片段或分段的基因；

（3）回收和纯化上述PCR产物，将相应分段基因进行酶切连接后，共获得10个基因片段；

（4）将步骤（3）获得的10个基因片段与pBD-initial载体酶切连接加入到JM109感受态细胞中进行转化培养，培养24h提取菌落质粒为模板进行酶切和序列测定鉴定；

（5） 将MDRV 10个片段的阳性质粒按比例混合共转染单层293T细胞，37℃,5%CO₂条件下，每天观察细胞病变情况；

（6） 在293T细胞上传代到第15代后，细胞病变开始稳定，在接毒后第4天出现细胞圆缩现象；6天出现细胞拉网，脱落现象；第7天时可以收毒；第15代传代毒MDRV-rMS-A15重组病毒毒价为10^-5TCID₅₀/0.1mL；

为了保持基因组RNA的完整性和纯度，步骤（1）可采用TRIzol试剂提取RNA；

步骤（4）提取的质粒可采用质粒提取试剂盒进行提取；

PCR引物需满足如下要求：

1）S1-S4片段各设计一对简并引物，上游引物在起始核苷酸的下游区域设计，下游引物在末端核苷酸的上游区域设计，设计的引物能够对MDRV S基因片段全序列进行阳性扩增；

2）M1、M2、M3基因各分成2段进行扩增，分别设计两对引物；

第一对上游引物在起始核苷酸的下游区域设计；第一对下游引物和第二对上游引物根据基因片段的一个酶切位点附近区域进行设计：M1基因1542-1547位 EcoRI、M2基因921-926 位EcoRV、M3基因1067-1072位 Bsp1407I；第二对下游引物在末端核苷酸的上游区域设计；

通过PCR扩增后将片段进行特异性酶切连接即可得到MDRV M基因片段全序列；

3）L1、L2、L3基因各分成3段进行扩增，分别设计三对引物；

MDRV 3959bp 的L1基因利用1424位NruI酶切位点和 2795位AclI 位点将L1基因分成三段进行扩增；3830bp的L2基因利用1441位SacI酶切位点和 2719位HpaI 位点将L2基因分成三段进行扩增；

3907bp的L3基因利用1497位EcoRI酶切位点和 2799位NaeI 位点将L3基因分成三段进行扩增；

4）设计PCR引物时按pBD-initial载体的要求，在上游引物5’端加上GCGCTAT七个碱基。

2.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于，步骤（1）从含有MDRV细胞毒中提取病毒基因组RNA。

3. 根据权利要求2 所述的方法，其特征在于，采用TRIzol试剂提取病毒RNA。

4. 根据权利要求1 所述的方法，其特征在于，步骤（2）采用高保真PCR。

5. 根据权利要求1 所述的方法，其特征在于，步骤（3） 采用纯化回收试剂盒回收PCR产物。

6. 根据权利要求1 所述的方法，其特征在于，还包括将步骤（4）所得MDRV基因组全序列与其它MDRV分离株基因组全序列进行同源性比对验证的步骤。

7. 根据权利要求1 所述的方法，其特征在于步骤（4）采用的pBD-initial载体可接纳长片段的DNA，在该载体上插入长片段的外源DNA时，不会破坏载体的自我复制性质。