[发明专利]一种橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法

说明书

本发明涉及真菌分离培养技术领域，具体涉及一种橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法，包括如下步骤：（1）取橙黄玉凤兰植株，洗净，风干；（2）将植株分解为主茎、叶片、根和块茎，并剪切成小段；（3）将小段用乙醇浸泡处理；（4）再用次氯酸钠浸泡处理；（5）吸干水分；（6）将根块、主茎、块茎和叶片分成小片，然后分别接种于含硫酸链霉素的PDA培养基中；（7）置于恒温培养箱中，培养。本发明的分离培养方法使用PDA培养基，采用硫酸链霉素选择出内生真菌，并在分离培养基上培养数日后，通过肉眼观察菌落形态进行真菌菌落形态观察，确定了菌株最适培养基和培养时间，为今后橙黄玉凤兰内生真菌的大批量培养奠定了基础。

技术领域

本发明涉及真菌分离培养技术领域，具体涉及一种橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法。

背景技术

兰花是被子植物中最多样化的一个科，包括许多重要的药用植物和观赏花类。在自然条件下，只有与某些真菌形成共生关系，兰花才能正常生长。由于其经济价值及其与真菌的特殊生物学关系，近年来，兰花已成为研究植物与真菌之间的间作关系、真菌多样性和特异性的重要材料。内生真菌可以与植物形成共生关系，成为一个互惠共生有机体。最近，一些学者提出了进化论假说:以植物和动物宿主形成共生微生物群体的多样性之间的关系在宿主进化适应环境压力和营养的发挥了重要作用，例如，内生真菌能促进宿主植物的生长，可以添加主机抵抗环境压力。因此，作为一种非常特殊的真菌群落，内生真菌群是真菌多样性的重要组成部分。

而现有技术中未见相关橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法的报道。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法，包括如下步骤：

（1）取橙黄玉凤兰植株，冲洗干净植物表面的沙土，用滤纸吸干植株表面的水分，置于有滤纸的干净培养皿中自然风干，然后转移至超净工作台；

（2）将风干后的植株分解为主茎、叶片、根和块茎，并剪切成3～4cm长的小段；

（3）将剪切后的小段用质量分数为65%-75%的乙醇浸泡处理1～3min；

（4）将乙醇浸泡后的小段取出，再用质量分数为2%-3%的次氯酸钠浸泡处理1～2min；

（5）将次氯酸钠浸泡后的小段取出，置于无菌吸水纸上吸干水分；

（6）将吸干水分后的根块分为面积为0.5～1.0cm²的小薄片，主茎和块茎剪成0.5～1.0cm长的小段，叶片切成面积为0.5～1.0cm²的小片，然后分别接种于含20-30μg/mL硫酸链霉素的PDA培养基中；

（7）将接种后的PDA培养基置于27-29℃恒温培养箱中，培养。

优选的，所述步骤（7）之后还包括步骤（8）内生真菌的纯化培养：当发现从组织块中长出菌丝体时，采用尖端菌丝挑取法，立即把菌丝体转移到纯化培养基平板上进行纯化培养，直到得到纯净无污染的菌落。

优选的，所述步骤（8）之后还包括步骤（9）内生真菌的形态学鉴定：将分离纯化得到的菌种在分离培养基上培养数日后，通过肉眼观察菌落形态进行真菌菌落形态观察并记录；然后采用直接挑取制片法，在显微镜下进行真菌形态观察，根据菌核的特征及结构，孢子着生部位及形态、大小、排列方式和有无隔膜显微特征，进行初步鉴定。

优选的，所述步骤（8）之后还包括步骤（10）对橙黄玉凤兰内生真菌进行PCR鉴定，具体包括如下步骤：

A、菌株的培养：取橙黄玉凤兰内生真菌的菌丝进行培养；

B、DNA提取：采用CTAB法提取菌体DNA；