[发明专利]假单胞菌zjut126及在生产L-草铵膦中的应用

说明书

本发明公开了一株假单胞菌Pseudomonas sp.zjut126及其在生产L‑草铵膦中的应用，能选择性水解外消旋N‑癸酰‑(D,L)‑草铵膦生成L‑草铵膦，选择性接近100％。此外，本发明采用萃取法分离反应生成的混合物，萃余液经浓缩、冷冻干燥，得到L‑草铵膦产品。L‑草铵膦萃取分离的收率94.6％，产品中L‑草铵膦含量92％，ee值95.2％。本发明方法成本低，效率高，易于规模化。

技术领域

本发明涉及一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)zjut126及在生物催化领域的应用，该菌株具有高手性选择性拆分外消旋N-癸酰-(D,L)-草铵膦生产L-草铵膦的能力。用简单的萃取法，就可以从反应混合物中分离得到高纯度的L-草铵膦。

背景技术

随着环保观念的加强和可持续发展战略的实施，高效、低毒、高活性、低残留已成为农药发展的必然趋势。一些手性化合物的不同对映体往往表现出不同活性。比如一种对映体活性是高效，另一种对映体却是低效甚至起相反的作用。草铵膦是一种高效、低毒、非选择性(灭杀性)触杀型除草剂，也是一种手性农药，只有L型草铵膦具备植物毒性。市售的草铵膦多为外消旋体。若能以单一的L-构型的形式投入使用，不仅可以提高产品药效，而且其使用量可以降低一倍。随着国家农药减量增效政策的实施，绿色生物农药成为研究热点，高光学纯度的L-草铵膦具有广阔的市场前景。

单一对映异构体可以由化学、生物法等合成。生物催化法优于化学法的优点是：酶(或细胞)催化反应通常有高的立体选择性和区域选择性，而且在温和的条件下进行，可以避免使用严酷的条件，从而避免副反应的发生。此外，生物催化法可以减少对环境污染，节省成本，符合当今绿色化学发展趋势。

目前工业上合成L-草铵膦的方法是化学法，例如日本的明治制果公司和中国永农生物科技有限公司合作开发的酮酸不对称加氢合成L-草铵膦的技术。但是化学方法能耗高而且污染严重。鉴于生物催化反应条件比较温和、立体选择性高、污染少等特点，未来生物法生产L-草铵膦将更有前景。本发明就是筛选生物法生产L-草铵膦的微生物细胞催化剂，将外消旋的N-癸酰-(D,L)-草铵膦立体选择性水解，生成L-草铵膦。

美国专利US 6,686,181B1(2004)报道了一种酶法生产L-草铵膦的方法。该酶是从能水解N-乙酰-(D,L)-氨基酸的氨基酸酰基转移酶中筛选出来的，它能立体选择性水解N-乙酰-(D,L)-草铵膦(注：草铵膦是一个非蛋白氨基酸)产生L-草铵膦，选择性接近100％。美国专利US 4,226,941(1980)报道了几种微生物菌种及其所含胞内酰基转移酶立体选择性水解N-短链脂肪酰-(D,L)-草铵膦生产L-草铵膦的方法，选择性接近100％。这些短链脂肪酰包括乙酰、丙酰和丁酰等，菌种的催化水解活性与脂肪酰的长度相关，随着链长的增加，细胞催化活性逐渐下降。当底物中酰基供体的链长增加2个，即从乙酰变成丁酰，细胞催化活性下降一半以上。该专利用于分离水解混合物得到纯L-草铵膦的方法是，用强酸性离子交换柱将混合物中未反应的N-短链脂肪酰-D-草铵膦，以及水解生成的短链脂肪酸和L-草铵膦分开。这三种物质水溶性都较好，不能用简单的方法(如萃取)分开，只能用操作复杂、成本高昂的离子交换法分离。由于分离成本在一个完整的产品生产工艺中往往占大头，所以本发明在发明起始的时候就考虑降低L-草铵膦分离的成本。方法是筛选能立体选择性水解N-长链脂肪酰-(D,L)-草铵膦的菌种，因水解混合物中未反应的N-长链脂肪酰-D-草铵膦，以及水解生成的长链脂肪酸和L-草铵膦这三种物质，只有L-草铵膦易溶于水，另外两种物质(因为含长链脂肪酰)都难溶于水，因此用萃取的方法可以简单地将它们分开。

发明内容