[发明专利]一种提高猪胰岛素纯度的色谱分离方法

说明书

本发明提供一种提高猪胰岛素纯度的色谱分离方法，本方法利用中低压色谱系统对猪胰岛素粗样进行分离提纯，使用离子交换色谱材料为固定相，洗脱的流动相为含有至少一种可与水混溶的有机溶剂和至少一种缓冲盐物质、pH值为3.5‑4.5。本发明所述的色谱纯化方法可以一步将粗样品中高分子杂质含量从4.0％降低至0.45％，回收率达90％。该色谱不但具有上样量大，回收率高等优势，且操作过程简单，重复性高，易于规模化生产，经济成本低。

技术领域

本发明涉及高纯度猪胰岛素的制备领域，尤其涉及一种提高猪胰岛素纯度的色谱分离方法。

背景技术

糖尿病是一种慢性代谢性疾病，患者由于胰岛素分泌缺乏或利用率低下，或胰岛素抵抗导致高血糖症，并伴有多饮、多食、多排尿以及体重明显减少的临床症状。长期的高血糖症以及体内代谢紊乱导致患者全身组织器官受到严重损害，尤其是眼、肾、心脑血管以及神经系统，患者最终由于并发症失去生命。鉴于糖尿病给人类健康带来的巨大危害以及逐年增加的医疗费用和患病人数，控制和治疗糖尿病成为一项刻不容缓的任务。

目前临床应用中，胰岛素是降低体内血糖最有效的药物，1型糖尿病患者和严重的2型糖尿病患者都必须注射胰岛素，补充胰岛素以控制血糖的水平，提高患者的生活质量的同时降低糖尿病并发症的发生。我国胰岛素的市场95％的由国外厂商垄断，价格比较昂贵，严重影响到我国糖尿病用药的安全；同时由于国外公司把持我国胰岛素市场，导致胰岛素在我国糖尿病患者的使用率较低。为了打破国外厂商对于我国胰岛素市场的垄断，提高国产胰岛素的竞争优势，势必需要对现有的胰岛素生产工艺进行革新，以降低生产成本。

现随着生物技术得飞速发展，胰岛素的质量控制标准也相应提高，这样只是采用传统酸碱、有机溶剂沉淀及结晶的提取方式纯化猪胰岛素并不能达到2015版《中国药典》中关于胰岛素的质量标准(满足有关物质(A21脱氨胰岛素不得大于5.0％，其他相关蛋白质不得大于5.0％)、高分子蛋白杂质(保留时间小于胰岛素峰的所有峰面积之和不得大于1.0％))的要求；且后期使用大孔树脂或色谱技术精纯回收率都较低。故需开发一种高效的分离纯化工艺来提高猪胰岛素提取物的纯度和收率。

发明内容

本发明的目的在于提出一种提高猪胰岛素纯度的色谱分离方法，用于解决目前猪胰岛素产品中高分子量杂质超标、载样量低、成本高等技术问题。

为达到上述目的，本发明提出一种提高猪胰岛素纯度的色谱分离方法，包括以下步骤：

步骤1：猪胰岛素的提取，包括以下步骤：

1.1：提取新鲜的猪胰组织并搅碎；

1.2：将搅碎的所述猪胰组织通过提取液提取两次或两次以上，以得到浸出液；

1.3：对所述浸出液进行去除杂蛋白和脂肪的处理，以得到澄清的浓缩液；

1.4：调节所述澄清的浓缩液的pH，向所述浓缩液内加入精盐，静置沉淀；

1.5：过滤出所述浓缩液内沉淀物，将所述沉淀物进行除脂肪和脱水处理；

1.6：将所述沉淀物真空干燥得到初提取物；

步骤2：猪胰岛素的粗纯化，包括以下步骤：

2.1：通过酸水溶解所述初提取物；

2.2：分离出所述酸水中的胰岛素沉淀；

2.3：将所述胰岛素沉淀溶解于酸中，以形成混合溶液；

2.4：对所述混合溶液进行结晶；

2.5：提取结晶物进行洗涤和真空干燥处理，得到猪胰岛素粗品；

步骤3：猪胰岛素的精细纯化，包括以下步骤：