[发明专利]干血片中胍基乙酸和肌酸浓度的定量检测方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种干血片中胍基乙酸和肌酸浓度的定量检测方法及试剂盒。将内标品液用干血斑萃取液稀释成工作液；之后将工作液加入样本中孵育；最后采用串联质谱法检测样本中胍基乙酸和肌酸浓度。本发明的方法可以使准确地检测各类型滤纸干血片中的胍基乙酸（GAA）和肌酸（CRE）浓度。

技术领域

本发明涉及生化检测设备技术领域，尤其涉及一种干血片中胍基乙酸和肌酸浓度的定量检测方法及试剂盒。

背景技术

肌酸缺乏综合征(creatine deficiency syndromes，CDS)是一组影响肌酸合成及转运的先天性遗传代谢性疾病，其生化特点为脑肌酸缺乏。临床表现为智力缺损、语言发育迟缓、孤独症、癫痫发作、肌张力减退、以锥体外系损害为主的运动障碍和行为问题等。CDS可能是众多原因不明精神发育迟滞儿童的致病原因，早期诊断并给予肌酸治疗，可改善预后。

肌酸缺乏综合征根据基因缺陷分为三种类型：精氨酸：甘氨酸脒基转移酶(arginine：glycineamidinotransferase，AGAT)缺陷、胍基乙酸甲基转移酶(Guanidinoacetate methyltransferase，GAMT)缺陷和肌酸转运蛋白SLC6A8基因缺陷。

GAMT缺陷患者在尿、血浆、脑脊液、滤纸干血片样本中出现胍基乙酸增高，肌酸和肌酐减低，肌酸/肌酐比值不变，但胍基乙酸/肌酸比值明显增高。应用滤纸干血片样本测定胍基乙酸和肌酸及其比值可用于GAMT缺陷的辅助诊断

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于串联质谱的干血片中胍基乙酸(GAA)和肌酸(CRE)浓度的定量检测技术及试剂盒。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种干血片中胍基乙酸和肌酸浓度的定量检测方法，包括如下步骤：

(1)制备内标品液：在内标品中加入纯水，混匀直至完全溶解，真空干燥制成内标品液；

(2)制备工作液：采用萃取液萃取干血斑获得干血斑萃取液，之后将步骤(1)制备的内标品液用干血斑萃取液稀释成工作液；

(3)利用打孔器将空白滤纸片、质控品滤纸片打孔，放入V截底型96孔板中，之后在各孔中加入步骤(2)制备的工作液；将96孔板密封放入孵育振荡器内孵育；

(4)振荡结束后，取孵育溶液，采用串联质谱法检测样本中胍基乙酸和肌酸浓度。

本发明的方法，所述步骤(1)中，内标品成分为d3-肌酸和d2-胍基乙酸。

所述步骤(2)中，干血斑萃取液可以在非衍生化的情况下使用，或经衍生化处理，在干血斑萃取液中加入衍生化试剂3N盐酸正丁醇，37℃下衍生化30分钟，获得衍生化干血斑萃取液。用干血斑萃取液/衍生化干血斑萃取液按体积110倍稀释成工作液；稀释后内标品浓度为1μmol/L。所述的萃取液为体积含量50–90％甲醇水溶液。

所述步骤(3)中，质控品包括低水平质控及高水平质控品，低水平质控品为3μmol/L胍基乙酸、50μmol/L肌酸；高水平质控品为8μmol/L胍基乙酸、300μmol/L肌酸。

利用打孔器将空白滤纸片、质控品滤纸片打孔，放入V截底型96孔板中，之后在各孔中加入工作液，将密封的V截底型96孔板置于孵育振荡器内，在温度为45±5℃，振荡频率为650–750转/分的条件下，振荡孵育45分钟。

所述步骤(4)中，通过多反应监控MRM模式检测，质谱条件见下表1：

表1胍基乙酸和肌酸测定的质谱条件

本发明还提供一种干血片中胍基乙酸和肌酸浓度的定量检测试剂盒，包括：