[发明专利]一种基于微量法的谷氨酰胺酶活性测定试剂盒及其方法

说明书

本发明公开了一种基于微量法的谷氨酰胺酶活性测定试剂盒及其方法，本发明的试剂盒包括磷酸氢二钠‑柠檬酸缓冲液的试剂一、谷氨酰胺水溶液的试剂二、TCA水溶液的试剂三、茚三酮粉剂的试剂四。本发明的测定原理为GLS催化谷氨酰胺水解成L‑谷氨酸和氨，首次利用茚三酮显色法测定谷氨酸的增加速率来间接反应GLS酶活性，具有独创性，同时，所用试剂茚三酮配制简单，为实验室常用试剂。本发明的测定方法通过合理设置对照管，可以排除杂质影响，检测专一性极高。本发明的测定方法重复性较好，变异系数(CV值)在2％以内。本发明的测定方法适用于动物、植物、微生物和培养细胞等各种样本，适用范围广。

技术领域

本发明属于生命科学领域，具体涉及一种基于微量法的谷氨酰胺酶活性测定试剂盒及其方法。

背景技术

GLS（EC 3.5.1.1）是谷氨酰胺酶，谷氨酰胺酶可催化谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨，在氮素代谢中，尤其是调节游离氨含量和尿素代谢中具有重要调控作用。目前已有的测定谷氨酰胺酶活性的方法为奈氏法，应用奈氏试剂测定氨的增加量来反映谷氨酰胺酶活性的高低。

不过，奈氏法缺存在以下几个缺点：1、配制繁琐，需要五种试剂，其中HgCl₂为剧毒品，一般实验室无法获得；2、该方法受到的干扰较大，存在假阳性；3、测定结果不稳定，重复性差。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明旨在提供一种基于微量法的谷氨酰胺酶活性测定试剂盒及其方法，具有试剂配制简单，检测专一性高，重复性较好和适用性广泛等特点。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种基于微量法的谷氨酰胺酶活性测定试剂盒，包括以下试剂：

试剂一，PH8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液60 mL×2瓶，4℃保存；

试剂二，0.05﹪的谷氨酰胺水溶液40 mL×1瓶，4℃保存；

试剂三，20﹪的TCA水溶液60 mL×1瓶，常温保存；

试剂四，茚三酮粉剂×1瓶，4℃保存。

进一步的，每瓶所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液均由0.1795g Na₂HPO₄、0.0347g柠檬酸和60mL蒸馏水混合而成，并置于60mL的容量瓶中。

进一步的，所述谷氨酰胺水溶液由0.02g谷氨酰胺和40mL蒸馏水混合而成，并置于40mL的容量瓶中。

进一步的，所述TCA水溶液由12g TCA和60mL蒸馏水混合而成，并置于60mL容量瓶中。

进一步的，所述茚三酮粉剂包含0.025g茚三酮，并置于5mL棕色瓶中。

一种利用上述试剂盒的基于微量法的谷氨酰胺酶活性测定方法，具体步骤如下：

步骤1 仪器和用品的准备；

准备台式离心机、可见分光光度计或酶标仪、微量石英比色皿或96孔板、可调式移液枪、研钵、冰和蒸馏水；

步骤2 粗酶液提取；

1）细菌、细胞样品的制备：

先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；然后按照一定比例加入试剂一，超声波破碎细菌或细胞；最后在离心率8000g，4℃下离心10min，取上清，置冰上待测；

2）组织样品的制备：

先称取组织；然后按照一定的比例加入试剂一，进行冰浴匀浆；最后在离心率8000g，4℃下离心10min，取上清，置冰上待测；

3）血清或血浆样品：直接检测；