[发明专利]一种测定壳寡糖含量的方法

说明书

本发明涉及一种测定壳寡糖含量的方法，属于大分子检测技术领域。本发明采用苯酚‑荧光分光光度法，利用壳寡糖与苯酚溶液混合后，壳寡糖的氨基和苯酚的羟基结合，使混合水溶液的pH值改变，苯酚发生荧光淬灭，导致荧光强度呈指数下降，使壳寡糖的浓度与荧光对数值在一定范围内呈线性关系，用于壳寡糖的含量测定。此方法费用低，灵敏度高，稳定性强，重现性好，检测浓度范围为0～2.4mg/ml，使用广泛，可用于不同剂型壳寡糖的含量测定，解决了现有技术中操作繁琐、成本高、准确性低、测定范围窄的问题。

技术领域

本发明属于大分子检测领域，涉及一种测定壳寡糖含量的方法。

背景技术

壳寡糖(又称寡聚氨基葡糖、甲壳低聚糖、Chitosan Oligosaccharide，Chito-oligosaccharide，Oligochitosan)由甲壳质(几丁质)脱乙酰化的产物壳聚糖降解获得，是由2-10个氨基葡糖通过β－1，4糖苷键连接而成的低聚糖，也是天然糖中唯一大量存在的碱性氨基多糖，水溶性好，易被动物体吸收。壳寡糖原材料来源广泛，安全无毒，其具有的抗炎、增强免疫力、抗肿瘤、抑菌、清除自由基、抗氧化等生理活性已引起国内外医药研究者的广泛关注。在作物栽培领域，壳寡糖具有调控植物生长和防治植物病害等生物活性，被作为抗病毒制剂，广泛用于黄瓜、番茄等多种蔬菜生产中。在医药领域，壳寡糖具有调节免疫力、抗氧化、抑制肿瘤生长及抗炎反应、增强骨强度、抗菌、抗疟疾等作用。因此在农业、食品、医药等领域具有广阔的应用前景。但是在壳寡糖产品的质量控制中，除了要测定壳寡糖的脱乙酰度、聚合度和相对分子量，还需要确定产品中壳寡糖的实际含量，现有方法对产品中壳寡糖的含量测定准确性低，致使产品中壳寡糖含量的测定方法的不成熟和馈乏。

当前，壳寡糖的含量分析方法主要有三大类：高效液相色谱法(HPLC)、薄层层析法(TLC)和分光光度法。HPLC法采用示差检测器检测或紫外检测器检测，该方法灵敏度高、准确可靠，但操作过程繁琐，样品处理和分析时间长。TLC法稳定性差，测定误差大，准确性低，无法保证测得产品质量优劣。分光光度法是较为传统的壳寡糖检测的方法，得到多次改进，但依然存在水解不彻底、含量测定范围低窄问题，增加测定结果的误差。另外，如中国专利申请号201711493051.2公开了一种以水溶性苯胺蓝为探针的紫外可见分光光度法测定壳寡糖，水解壳寡糖也可利用紫外分光光度法精确测得壳寡糖含量，但是该方法中苯胺蓝-壳寡糖体系受温度、pH值影响，操作步骤多，稳定性差。综上，壳寡糖含量的测定方法依然需要不断的改进和更新。因此，建立一种简单易行而又准确的测定产品中壳寡糖含量的方法极为迫切。

发明内容

为改进现有技术中对壳寡糖的含量测定方法误差大、稳定性低，耗时费力，尤其是不能广泛应用于壳寡糖不同制剂含量测定等缺点，本发明旨在提供一种测定不同剂型壳寡糖含量的方法。本发明采用苯酚-荧光分光光度法，利用壳寡糖与苯酚溶液混合后，壳寡糖的氨基和苯酚的羟基结合，使混合水溶液的pH值改变，苯酚发生荧光淬灭，导致荧光强度呈指数下降，使壳寡糖的浓度与荧光对数值在一定范围内呈线性关系，可用于壳寡糖的含量测定。此方法费用低，灵敏度高，稳定性强，重复性好，检测浓度范围为0～2.4mg/ml，使用广泛，可用于壳寡糖片剂、颗粒剂和滴丸等不同制剂中壳寡糖的含量测定。

一种测定壳寡糖含量的方法，包括如下步骤：

1)绘制壳寡糖的标准曲线：向比色管中分别加入0、0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml充分溶解于蒸馏水的4.00mg/ml的壳寡糖标准品储备液，后加入100μl苯酚水溶液，蒸馏水定容，摇匀，制备得到浓度梯度为0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00、2.40mg/ml的壳寡糖标准溶液，于荧光分光光度仪上测定荧光强度值F，建立lnF与壳寡糖浓度X之间的线性关系；

2)样品工作液的配备：取壳寡糖待测样品，加入蒸馏水，混合均匀，配制成浓度为3～5mg/ml的壳寡糖溶液；