[发明专利]一种从脐带组织中分离间充质干细胞的方法

说明书

本发明公开了一种从脐带组织中分离间充质干细胞的方法，包括以下步骤：脐带采集与运输；脐带组织的预处理；对脐带华通胶组织块进行贴壁培养。本发明通过分离方法，探索一种高效连续，能够利用宝贵而有限的脐带组织，最大限度的提高脐带组织利用率以及间充质干细胞获得率、纯化率的同时，缩短间充质干细胞获得周期的方法和路径。

技术领域

本发明属于再生医学生物技术领域，具体地说，涉及一种从脐带组织中分离间充质干细胞的方法。

背景技术

脐带间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。脐带间充质干细胞(MSCs)具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨，软骨，肌肉，肌腱，韧带，神经，肝，内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。

目前从脐带中分离间充质干细胞的主要方法有组合酶消化法和组织块贴壁法。酶消化法普遍采用0.25％胰蛋白酶+0.1％胶原酶I型等体积混合对剪碎的脐带组织进行过夜消化10-24小时，经过离心分离获得间充质干细胞基质层成分，接种于内表面处理后的培养耗材中，添加适量的干细胞完全培养基，放入二氧化碳培养箱5.0％37℃培养；其缺点是脐带间充质干细胞大部分被消化酶消化裂解，脐带组织只能利用一次，间充质干细胞获得率低，由于消化残留的血管内皮和表皮组织存在导致分离出的原代间充质干细胞纯度很低同时残留酶对细胞生长也有较大的抑制作用。

传统贴壁法，采用PBS液体或0.9％生理盐水反复多次洗净脐带组织中的脐带血后，采用组织粉碎机破碎或医用组织器械剪碎，直接贴壁到表面贴壁处理后的培养耗材中，加入干细胞完全培养基铺满包围所有贴壁组织块，放入二氧化碳培养箱5.0％37℃培养，每隔3-5天换一次液直至原代细胞长满(需要10-15天)；原代长满后，将贴壁的组织块废弃处理，原代细胞传代扩增培养；其缺点是由于没有去除脐带表皮组织和脐带内血管组织，脐带分离获得原代间充质干细胞的周期较大大延长(至少10-15天，原代干细胞才能达到传代扩增水平)，同时原代间充质干细胞长出伴随着大量的表皮细胞和血管内皮成纤维细胞，从而使目的细胞纯度大大很低，传统贴壁法贴壁一次后，贴壁脐带组织被废弃掉也导致脐带组织利用率很低，难以满足未来市场化的需求。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种从脐带组织中分离间充质干细胞的方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种从脐带组织中分离间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

步骤1、脐带采集与运输；

步骤2、脐带组织的预处理；

步骤3、对脐带华通胶组织块进行贴壁培养。

可选地，所述步骤1中的脐带采集与运输具体为：按照无菌操作要求采集脐带，符合脐带供者采集标准，长度不小于15厘米，保持完整，无针眼及破损，尽量避免脐带与其他物品接触，浸入采集瓶的保存液中，密封标注，4°低温转运箱尽快送往实验室，整个过程不超过12小时。

可选地，所述步骤2中的脐带组织的预处理具体为：

步骤2.1、提前半小时将生物安全柜开机，窗口调至工作位置等待绿色LED“稳定气流”亮起，将脐带用止血钳从采集瓶中无菌取出，放入生物安全柜操作台内准备好的玻璃皿中，75％酒精浸没处理2分钟；

步骤2.2、用止血钳夹出脐带转移入新的皿中，0.9％生理盐水浸没清洗一遍，并用手术剪将脐带组织剪成2cm长组织块，用敷料镊挤出组织块中残留血液；

步骤2.3、用0.9％生理盐水反复清洗组织块，2-3次，直到浸没组织的生理盐水澄清透明；