[发明专利]同时检测含胶类药材制品中多种动物源性成分的方法

说明书

本发明公开了一种同时检测含胶类药材制品中多种动物源性成分的方法，包括以下步骤：制备对照混合溶液：取阿胶、黄明胶和龟甲胶3种对照药材混合，用碳酸氢铵溶液提取、定容，将提取后的提取液用胰蛋白酶进行酶水解，得到对照混合溶液；按同样的方法制备供试品溶液；用超高效液相色谱‑二级串联质谱法分别对对照混合溶液和供试品溶液进行测试，对胶类药材制品中驴源性成分、龟源性成分及掺入的牛源性成分同时进行定性和定量分析。本发明可以同时检测胶类药材制品中多种动物源性成分，准确度高、专属性强，能够控制胶类药材按处方量投料，保障制品的质量。

技术领域

本发明涉及一种同时检测含胶类药材制品中多种动物源性成分的方法。

背景技术

胶类药材是指由动物的皮、骨骼等经过特殊工艺加工而成的胶，多数具有滋阴补血的功效，如阿胶、龟甲胶等。阿胶为马科动物驴的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶，故阿胶来源于驴。龟甲胶为龟甲经水煎煮、浓缩制成的固体胶，故龟甲胶来源于龟。胶类药材因生产用的动物原料有限，且饲养成本高，为降低成本，出现用低价易得的牛皮胶替代阿胶、龟甲胶等胶类药材的市场现状，影响了胶类药材及其制品的质量。胶类药材主要成分为胶原蛋白，利用蛋白质或氨基酸通用型检测方法，如电泳法、高效液相色谱法、薄层色谱法等方法，专属性差，不能很好地鉴别不同胶类药材的动物源性成分。PCR技术是鉴定动物源性比较成熟的技术，但胶类药材是经高温煎煮后，DNA被严重破坏，残存留极地，且制品中还有其它多种药味，目前，PCR技术未能用于胶类药材及其制品的检测。

胶类药材制品包括含胶类药材的中成药和保健品，胶类药材制品与单味胶类药材相比，存在药味多、成分复杂，以及处方工艺不同等特征，因此测定胶类药材制品中胶类成分的检测技术手段有限。目前主要是采用凯氏定氮法测定总氮量，采用薄层色谱法、高效液相色谱法和高效液相质谱联用法对游离或水解后的氨基酸成分进行测定，这些检测方法主要测定含氮量和氨基酸含量。氮是合成蛋白质基本元素，蛋白质是由不同氨基酸序列组成，胶类药材主要成分为动物类胶原蛋白，胶原蛋白具有相似的化学性质，其组成胶原蛋白的氨基酸种类也具有相似性，采用测定氮和氨基酸的检测方法，专属性不强，无法区分不同来源的动物源性成分，不能判定制品中胶类成分的真实质量，需建立专属性强的检测方法，测定制品中胶类成分。

胶类药材主要为胶原蛋白成分，目前采用常规检测大分子蛋白质技术均没有寻找到不同动物源胶原蛋白特有成分，以胶原蛋白特有成分作为控制指标的方法是不可行的。酶切技术和超高效液相色谱质谱串联技术是当前用于蛋白质分析比较成熟的方法，利用酶切技术将胶类药材进行特异性酶切，再采用超高效液相色谱质谱串联技术对酶解后的样品进行分析，对动物源性成分特有的肽段进行归属，通过统计学模型寻找到阿胶4个双电荷特征离子，分别为618.7、469.2、765.8、539.8；龟甲胶3个双电荷特征离子745.9、631.3、758.4；黄明胶4个双电荷特征离子，分别为747.3、641.3、790.8、604.8，最后选择信号稳定、响应值高的母离子m/z 539.8、m/z 631.3和m/z 641.3作为测定离子。最后在此基础上，2015年版《中国药典》收载了以m/z 539.8→923.8、612.4离子对作为阿胶特征成分的鉴别方法和以m/z 631.3→546.4、921.4离子对作为龟甲特征成分的鉴别方法；国家食品药品监督管理局也已经批准以m/z 641.3→726.2、783.3作为牛源成分来源的补充检验方法，故阿胶、龟甲和黄明胶特征离子作为阿胶药材鉴别的方法是可行的。然而，《中国药典》中阿胶和龟甲胶质量标准仅限于鉴别，该方法仅限于鉴别药材中的驴源性成分和龟源性成分，而含阿胶和龟甲胶制品均未收载此类方法。在日常检验工作中发现，驴源性成分和龟源性成分含量仅1％也能被检测，并判定为合格，用该方法检测仍然不能判定阿胶和龟甲胶质量的优劣，且针对其它皮类如牛皮替代投料情况，未同时测定。